Moving towards an improved experimental model for reproduction of pneumonia induced by Mycoplasma hyopneumoniae

Abstract

La infecció per Mycoplasma hyopneumoniae està àmpliament estesa per la majoria de països productors de porcí. Malgrat la seva importància, encara hi ha punts rellevants que queden per resoldre; alguns d'ells referents a la complexa patogènesi de la infecció així com de la pneumònia que en resulta. Tot i que els models experimentals de M. hyopneumoniae són un bon punt de sortida per tractar aquestes qüestions, en aquest escenari s'observa una àmplia variabilitat tant en la reproductibilitat com en la prevalença i la gravetat de la pneumònia. Aquesta variabilitat és preocupant, per exemple, en el cas de voler complir amb els requisits d'eficàcia per a productes medicamentosos d’ús veterinari, especialment en el cas de les vacunes, ja que es demana una reducció significativa de les lesions pulmonars al comparar amb les de porcs no vacunats. Així doncs, un model experimental de M. hyopneumoniae validat i que asseguri la reproducció de pneumònia és d'interès. Aquesta tesi, de fet, es va plantejar per identificar i optimitzar les condicions experimentals que més poden influenciar el desenvolupament de pneumònia. A més, també s'hi avaluen paràmetres ante-mortem amb cert potencial per predir la prevalença i la gravetat de pneumònia.

El primer estudi tenia com a objectiu identificar determinants per a la reproducció de pneumònia en condicions experimentals. Per aconseguir-ho, es va realitzar una revisió sistemàtica de la literatura seguit d'un anàlisi estadístic multivariant, denominat anàlisi recursiu de partició. Els resultats proporcionats constitueixen una primera visió de les condicions que donen suport al desenvolupament de pneumònia en entorns experimentals. Així, els models experimentals de M. hyopneumoniae que persegueixen la reproducció de pneumònia han d'avaluar les lesions pulmonars dins d'un període d'estudi de 8 setmanes i incloure inoculació de porcs lliures de M. hyopneumoniae, majors de 3.5 setmanes d'edat i co-infectats amb un altre patogen respiratori porcí. A més, dues condicions experimentals van ser avaluades de forma individual en els següents capítols. En el segon estudi es va comparar la pneumònia resultant de la inoculació artificial de M. hyopneumoniae mitjançant tres rutes diferents (endotraqueal, intranasal i aerosol). Com a resultat, la via endotraqueal va resultar ser la millor ruta d'inoculació per induir pneumònia en un període de 4 setmanes després de la inoculació. D'altra banda, en el tercer estudi es van usar diferents tècniques per al seguiment diari del creixement en cultiu de soques de M. hyopneumoniae de diferent patogenicitat. D'aquesta manera, aquestes tècniques es van poder avaluar com a possibles metodologies de titulació. Els resultats obtinguts demostren que aquelles tècniques que titulen els cultius a temps real es poden utilitzar per descriure el creixement in vitro de M. hyopneumoniae. Això ajuda a normalitzar els protocols de cultiu d'aquest patogen al laboratori, així com la producció d'inòculs per a aplicacions experimentals. L’últim estudi avaluà la capacitat de diferents paràmetres de la resposta immunitària humoral, tant a nivell local com sistèmic, per predir ante-mortem tant l'ocurrència com la gravetat de les lesions pulmonars associades a M. hyopneumoniae. En aquest cas, aquesta avaluació es va realitzar tant en porcs infectats experimental com naturalment. En general, els resultats indiquen que els paràmetres immunològics humorals es poden utilitzar per predir pneumònia sota un enfocament poblacional. Aquest capítol també descriu una resposta humoral sistèmica on predomina la subclasse IgG2 enfront el patogen.

The infection with Mycoplasma hyopneumoniae is widespread in almost all pig producing countries. Despite its importance, there are still relevant points to be resolved; some of them concern the complex pathogenesis of the infection as well as the resultant pneumonia outcome. For instance, M. hyopneumoniae experimental models are a good starting point for addressing some of these unresolved matters, although wide inconsistencies are seen in reproducibility, prevalence and severity of pneumonia. Among others, the latter is a major concern in the case of veterinary medicine product efficacy compliance, especially in vaccinology, where a significant reduction in the lung lesion score is required compared to non-vaccinated pigs. Thus, a validated M. hyopneumoniae experimental model enhancing severe pneumonia reproduction is of interest. Therefore, the present thesis was raised to provide insights into this matter through the identification and optimization of experimental conditions playing a role in pneumonia outcome. Furthermore, evaluation of ante-mortem parameters that would serve to foresee such outcome was also addressed.

The first study aimed to identify determinants for the successful reproduction of pneumonia under experimental conditions. To reach this goal, a systematic review of the literature followed by a multivariable statistical analysis, named recursive partitioning, was done. The results obtained constitute the first insight into those conditions supporting pneumonia development under experimental settings. M. hyopneumoniae experimental models pursuing reproduction of severe pneumonia should assess lung lesions within a study period of 8 weeks and include inoculation of M. hyopneumoniae-free pigs older than 3.5 weeks of age and co-infected with another swine respiratory pathogen. Besides, other two experimental conditions were further investigated individually into the following chapters. In the second study, pneumonia outcome consequence of M. hyopneumoniae inoculation by means of three inoculation routes (endotracheal, intranasal and aerosol) was compared. As a result, the endotracheal was the most optimal route of inoculation to induce severe pneumonia within a period of 4 weeks after inoculation. On the other side, in the third study, the growth in culture of M. hyopneumoniae strains differing in pathogenicity was daily followed by different techniques, which were evaluated as putative titration methodologies. Results obtained proved that real-time culture titration assays can be used to describe the in vitro growth of M. hyopneumoniae and to standardise M. hyopneumoniae culture protocols in the laboratory as well as inoculum production for experimental applications. The last study evaluated different humoral immune response parameters, both at local and systemic levels, as ante-mortem predictors of occurrence and severity of lung lesions associated with M. hyopneumoniae. Such an evaluation was done either in experimentally and naturally infected pigs. Overall, results indicated that humoral immune parameters may be used as pneumonia predictors in a population-based approach. Moreover, a new insight into the humoral immune response against M. hyopneumoniae is provided by reporting a predominant IgG2 systemic response.