Unravelling 3D cargo transport dynamics at the microtubule network with super-resolution microscopy

Abstract

Intracellular transport plays an essential role in a wide variety of fundamental cellular processes required to maintain the internal regulation and organization of cells. Different types of cargos such as organelles, secretory vesicles, mRNAs or protein complexes must be rapidly and efficiently delivered to a specific location at the right time. Molecular motors such as dynein and kinesin actively transport these cargos along the cellular highways that form the microtubule cytoskeleton, by transforming chemical energy into mechanical work. Intracellular transport is tightly regulated at multiple levels, including regulation by scaffolding proteins, motor proteins clustering or the cellular cytoskeleton. Among these regulatory mechanisms, the role of the microtubule cytoskeleton on cargo transport regulation is possibly the least well-understood. The complex three-dimensional geometry of the network along with the crowded environment of the cell cytoplasm complicate vesicular and organelle transport. Indeed, motor proteins have to overcome different types of obstacles and traffic jams in order to reach their final destination. Accumulation of obstacles on microtubules can lead to intracellular transport breakdown, which has been linked to several types of diseases, especially those of the nervous system. Understanding the molecular mechanisms by which transport is regulated as well as how motor proteins overcome obstacles during transport can thus give important clues as to how these mechanisms may break down in disease states. The main goal of this thesis has been to provide new insights on intracellular cargo transport dynamics in the nanoscale context of the microtubule network and in the physiologically relevant environment of a living cell. The visualization of such biological processes in vivo requires high spatial and temporal resolution and represents an important technical challenge due to the lack of pre-existing, adapted imaging tools with such technical capacities. We thus developed a novel correlative approach combining the cutting-edge technology of single particle tracking and super-resolution microscopy techniques in order to provide nanometer spatial and millisecond temporal resolution. This pioneering approach allowed us to image for the first time in living cells the dynamics of intracellular cargo transport in the nanoscale, three-dimensional context of its underlying network of cytoskeletal tracks. This thesis explores the role of the microtubule cytoskeleton on cargo transport regulation as well as the cellular mechanisms required to evade different types of obstacles during transport. Microtubule intersections act as distribution centers for cargo transport, providing multiple routes for cargos to be delivered to the proper location of function. The three-dimensional organization of the microtubule cytoskeleton impacts cargo transport dynamics at these intersections such that cargos predominantly pause at tight intersections with an intersection spacing <100 nm, likely because the intersecting microtubule constitutes a roadblock. Moreover, microtubule intersections differentially regulate cargo transport by acting as selective, size-dependent steric filters favoring the smooth trafficking of vesicles <250 nm. Finally, the inherently three-dimensional nature of cargo transport and the capability of cargo-bound motors to perform off-axis motion seems to be a preferential mechanism to evade different types of obstacles such as microtubule intersections or other cargos encountered during transport. Overall, this thesis provides new insights into the role of the microtubule cytoskeleton on cargo transport regulation, three-dimensional cargo transport motility, and the mechanisms involved in overcoming different types of obstacles during transport. We hope these novel findings will pave the way for a better understanding of several diseases caused by intracellular transport anomalies.

El transport intracel·lular té un paper essencial en una gran varietat de processos fonamentals per a la regulació interna de la cèl·lula. Diversos tipus d¿orgànuls, vesícules, ARN missatgers o complexos proteics han de ser distribuïts de manera ràpida i eficient en el lloc adequat en el moment precís per tal de dur a terme les seves funcions específiques. Els motors moleculars tals com la dineïna i la kinesina transporten aquestes càrregues per la xarxa de microtúbuls mitjançant la conversió d¿energia química en treball mecànic. El transport intracel·lular està altament regulat a múltiples nivells incloent la regulació mitjançant proteïnes de suport, agrupament i localització de motors moleculars o a partir del citosquelet cel·lular. La funció del citosquelet de microtúbuls en la regulació del transport intracel·lular és potser el mecanisme menys entès. La geometria tridimensional de la xarxa de microtúbuls i l¿aglomeració molecular característica del citoplasma dificulten el transport i, per tant, els motors moleculars han de superar diversos tipus d¿obstacles per tal d¿arribar al seu destí final. L¿acumulació d¿obstacles en els microtúbuls pot desencadenar un col·lapse del transport. A més, aquest fet ha estat relacionat amb diversos tipus de malalties, especialment aquelles relacionades amb el sistema nerviós. Una millor comprensió dels mecanismes reguladors del transport intracel·lular així com dels processos necessaris per tal de superar diversos tipus de barreres durant el transport podria proporcionar-nos un millor enteniment dels mecanismes que deixen de funcionar en aquest tipus de malalties. L¿objectiu principal d¿aquesta tesi és el de proporcionar un coneixement més ampli del transport intracel·lular en el context nanomètric de la xarxa de microtúbuls i en l¿ambient fisiològic de la cèl·lula. Visualitzar aquest procés amb una elevada resolució espacial i temporal en cèl·lules vives és tècnicament complicat degut a la manca d¿eines òptiques amb aquestes capacitats tècniques. En aquesta tesi introduïm un nou mètode correlatiu que combina la tecnologia puntera del ¿single particle tracking¿ amb la microscòpia de super-resolució per tal de proporcionar una resolució espacial i temporal de l¿ordre de nanòmetres i mil·lisegons, respectivament. Aquesta metodologia pionera ens ha permès visualitzar per primer cop en cèl·lules vives la dinàmica del transport intracel·lular en el context nanomètric i tridimensional de la xarxa de microtúbuls. La funció de la xarxa de microtúbuls en la regulació del transport intracel·lular i els mecanismes necessaris per a eludir diversos tipus d¿obstacles durant aquest transport han estat explorats al llarg d¿aquesta tesi. Les interseccions entre microtúbuls proporcionen múltiples rutes per a la distribució de vesícules i orgànuls. La geometria tridimensional de la xarxa de microtúbuls afecta la dinàmica del transport en les interseccions de tal manera que les vesícules es paren en aquells encreuaments amb una separació entre microtúbuls <100 nm, probablement degut a que la intersecció representa un obstacle al moviment. A més, les interseccions regulen de manera diferencial el transport de vesícules actuant com a filtres selectius que afavoreixen el transport de vesícules de dimensions <250 nm. La naturalesa tridimensional del transport intracel·lular i la capacitat dels motors moleculars per generar moviments fora del seu eix característic sembla ser un mecanisme preferent a l¿hora d¿eludir obstacles tals com les interseccions entre microtúbuls o d¿altres vesícules trobades en el camí. Aquesta tesi proporciona noves idees sobre la funció del citosquelet de microtúbuls en la regulació del transport intracel·lular, la naturalesa tridimensional del transport, i els mecanismes necessaris per a superar diversos tipus d¿obstacles durant el transport. Esperem que aquestes troballes facilitin un millor enteniment de les diverses malalties causades per anomalies en el transport intracel·lular.