Insight into the structure and function of engineered biocatalysts: serine hydroxymethyltransferase from Streptococcus thermophilus and halohydrine dehalogenase D2 from Gammaproteobacterium

Abstract

The rapid progress in structural and molecular biology over the past fifteen years has allowed chemists to access the structures of enzymes, of their complexes and of engineered variants. This wealth of structural information has led to a surge in the interest in enzymes as elegant chemical catalysts of industrial application. The study of structure-function of enzymes is central for designing active-site-directed mutations that expand the catalytic repertoire of enzymes properties.

In this study, the structure of two enzymes interesting for different biocatalytic applications was determined in order to shed light on their catalytic reaction mechanism and guide protein engineering experiments. The crystal structure of a novel serine hydroxymethyltransferase from Streptococcus thermophilus (SHMT) at 2.2 Å resolution, in the unliganded form and in complex with glycine and L-threonine was determined. Furthermore, two active-site variants have been functionally characterized in complex with natural and non-natural substrates. No active site catalytic residues were revealed, and a structural water molecule was assumed to act as catalytic base in the retro-aldol cleavage reaction. Moreover the X- ray analysis of the variants complexes explains the molecular bases of their enhanced activity and broad substrate tolerance. Halohydrin dehalogenase D2 from Gammaproteobacterium was also studied and its structure was solved at 1.6 Å resolution using a new method, Arcimboldo_Shredder, that exploits fragments from distant homologs to phase macromolecular structures. A similar structure and catalytic mechanism to previously reported protein of the same family was revealed. These results broaden the insight into the structural determinations that govern the reactivity and selectivity in the haloalcohol dehalogenase family and open the possibility to a rational re-design of them.

El rápido progreso en el campo de la biología estructural y molecular de los últimos quince años ha permitido a los químicos tener acceso a las estructuras de las enzimas, de los complejos enzimáticos, y a la ingeniería de sus variantes. La riqueza de la información estructural disponible ha guiado el interés hacía las enzimas como nuevos y reveladores catalizadores químicos para diversas aplicaciones industriales. El estudio de la relación función-estructura de las enzimas tiene un papel central en el diseño de mutaciones de sitio-dirigidas, que permiten expandir el repertorio de las propiedades enzimáticas. En este estudio, se ha determinado la estructura de dos enzimas importantes para diferentes aplicaciones industriales, con el objetivo de elucidar el mecanismo catalítico de las mismas y guiar los experimentos de ingeniería proteica. La estructura cristalográfica de una nueva serina idrossimetil-transferasi de Streptococcus thermophilus ha sido determinada con una resolución de 2.2 A, en su forma apo (libre de ligaduras), y en complejo con intermedios de reacción: glicina y L- threonina. Adicionalmente, han sido caracterizadas dos variantes enzimáticas a nivel funcional en complejo con substratos naturales y no-naturales. Gracias al análisis estructural, es posible afirmar que ningún residuo aminoacidico presente en el sitio activo actúa como base catalítica en la reacción inversa retro-aldolica, y que a cambio, la especie involucrada en esta función es un agua cristalográfica. El análisis estructural de los complejos, además, permite explicar las bases moleculares que dominan la mayor reactividad de las variantes y su tolerancia con respecto a los distintos substratos.

La estructura de la dehalogenasa D2 de Gammaproteobacterium fue también determinada a 1.6 A, usando un nuevo método llamado ¨Arcimboldo_Shredder¨. El mismo se sirve de fragmentos derivados de homólogos distantes de la proteína estudiada, para así obtener las fases de la estructura macromolecular. Analizando la estructura de la proteína, se ha revelado un mecanismo enzimático parecido a los que han sido previamente reportados para enzimas pertenecientes a la misma familia. Los resultados obtenidos permiten expandir los conocimientos de los principios estructurales que dominan la incrementada reactividad y selectividad de la familia de las alcol dehalogenasas y abren las puertas al re-diseño racional de las mismas.