Determinants estructurals i implicacions funcionals de l'interactoma proteic d'hCNT1

Abstract

Els nucleòsids són metabòlits imprescindibles per a la cèl·lula ja que són els precursors d’un gran nombre de biomolècules. Aquests nucleòsids poden ser sintetitzats per la cèl·lula o es poden recuperar del medi extracel·lular mitjançant proteïnes transportadores. Aquestes proteïnes són els transportadors de nucleòsids, que estan englobades en dues famílies gèniques: SLC28 i SLC29. La família SLC28 codifica per als transportadors concentratius o CNTs (Concentrative Nucleoside Transporters) i la família SLC29 codifica per als transportadors equilibratius o ENTs (Equilibrative Nucleoside Transporters). Aquestes proteïnes també són les encarregades d’internalitzar dintre de la cèl·lula els fàrmacs que són derivats de nucleòsids i que són emprats en diferents tipus de càncer, malalties víriques o inflamatòries. A part de transportar nucleòsids i els derivats, aquestes proteïnes tenen funcions addicionals al transport, el que els conferiria propietats de transceptors. Per tant, l’estudi d’aquestes proteïnes és d’importància notòria a nivell biomèdic. D’entre tots els transportadors de nucleòsids, aquesta tesi s’ha centrat en analitzar el paper de la proteïna hCNT1 codificada en el gen SLC28A1. Cada cop existeixen més evidències de que aquesta proteïna està realitzant funcions addicionals a la capacitat de transportar els seus substrats dintre de la cèl·lula. La restitució de l’expressió d’hCNT1 en línies d’adenocarcinoma pancreàtic indueix canvis fenotípics importants per a la biologia tumoral. A més, també s’ha descrit que l’expressió d’aquest transportador es veu reduïda en alguns tipus de processos oncogènics. Aquestes evidències ens van fer plantejar l’estudi d’hCNT1 des d’un punt de vista on es pogués demostrar el rol del transportador i la seva rellevància fisiològica. Es va tenir accés a unes dades clíniques que semblarien correlacionar per primer cop una malaltia de fenotip sever amb una nova mutació descrita per a hCNT1, si bé no podem descartar que la severitat del fenotip sigui causada per una combinació atzarosa amb diferents alteracions en el mateix gen o en altres gens. Aquesta mutació mostra un dèficit en la recaptació de nucleòsids que seria causat per uns nivells d’expressió del mutant inferiors a la proteïna wild type. Els resultats suggereixen que aquesta proteïna mutant podria tenir una vida mitjana inferior. Si finalment es confirma que les alteracions en el gen SLC28A1 són les causants d’aquest fenotip tan sever es reforçaria la idea de la importància fisiològica d’hCNT1. El domini amino terminal és una adquisició evolutiva dels CNTs eucariotes respecte dels procariotes i no és un domini estrictament necessari per al transport de nucleòsids (Hamilton et al., 2001). Per tal d’estudiar si les funcions transceptores d’hCNT1 resideixen en aquest domini, ens vam plantejar fer un estudi molecular del mateix. Per aquesta raó es va decidir dissenyar proteïnes quimèriques bescanviant els dominis amino terminal entre els diferents membres de la família gènica SLC28. En assajos preliminars, no semblaria que el fet de bescanviar el domini amino terminal d’hCNT1 amb el dels altres hCNTs sigui suficient per generar aquestes funcions transceptores. La funció transceptora també podria ser causada per les proteïnes que estiguessin interaccionant amb hCNT1. Amb una tècnica de doble híbrid es va trobar prosaposina com a possible interacció amb hCNT1 i es va realitzar l’estudi bioquímic i funcional de la interacció. Malauradament els anticossos dels que disposàvem no eren específics i no es va poder concloure la validació bioquímica, tot i que en fer estudis funcionals sí que vam observar que al silenciar prosaposina observem una caiguda d’activitat d’hCNT1, intuint així una possible regulació funcional entre totes dues proteïnes. Mitjançant la tècnica MYTH (Membrane Yeast Two-Hybrid), es van trobar tres proteïnes d’interacció amb hCNT1. Es va estudiar la implicació funcional de la interacció amb RNF41. Hem pogut constatar que RNF41 sembla estar modulant l’estat d’ubiqüitinació d’hCNT1 i aquest canvi afecta a l’activitat biològica del transportador.

Nucleosides are essential molecules for a living cell as they are precursors of key biomolecules. They can be synthesized inside the cell or taken up from the extracellular milieu by membrane proteins. These proteins are the nucleoside transporters. A part from internalizing nucleosides and their derivatives that are used as drugs for different therapies, these transporters mediate accessory functions acting as transceptors. This brief background reveals the biomedical relevance of the study of these proteins. Among all nucleoside transporters, this project has focused on the protein hCNT1 (human Concentrative Nucleoside Transporter) encoded in the gene SLC28A1. There is increasing evidence that this protein promotes cellular changes when its expression is restored in a translocation independent manner. Furthermore, in oncogenic processes its expression is lost in specific tissues. These evidences prompted us to plan a study of hCNT1 where it could be demonstrated the biological function of this transporter and its physiological relevance. One evidence that strengths the biological importance of the SLC28A1 gene was the discovery of a new mutation apparently related to a severe pathology. The molecular study of this mutated protein showed a decrease in the nucleoside uptake compared with the wild type protein. This decrease in the activity was caused by a reduction in the expression that it seems to be related to differences in protein turnover. In order to demonstrate the mechanisms of the transceptor functions described for hCNT1 we decided to unveil the protein interactome of the transporter. Previous studies in our research group using a bacterial two-hybrid, discovered prosaposin as a putative hCNT1 partner. We discovered a functional connection between both proteins but the biochemical validation was impossible due to the lack of specific antibodies. Using an alternative and more updated technique, the Membrane Yeast Two-Hybrid, we could find three new interacting proteins. One of the proteins was RNF41, and the interaction was confirmed by other methods. Moreover, we could spot some sort of regulation between them, the function of this interaction seems to be regulating the ubiquitination state of hCNT1 and this modification appears to modulate the uptake activity of the transporter.