Function of microRNAs in plant innate immunity

Abstract

Esta tesis aborda el estudio de miARNs en la inmunidad innata en plantas. El trabajo se ha desarrollado en arroz (Capítulo I y Capítulo II) y en Arabidopsis (Capítulo III), En el capítulo I se describe la identificación y caracterización funcional de nuevos miARNs de arroz en su interacción con el hongo Magnaporthe oryzae. Este hongo es responsable de la piriculariosis, una de las enfermedades más devastadoras para el cultivo del arroz a nivel mundial. A partir de la información generada mediante secuenciación masiva de bibliotecas de pequeños ARNs de arroz, se seleccionaron secuencias candidatas a representar nuevos miARNs de arroz, habiéndose estudiado 5 de estos candidatos (miR-64, miR-75, miR-96, miR-98 y miR-203). La obtención de líneas transgénicas de arroz ha permitido demostrar que la sobreexpresión de MIR-64 y MIR-75 confiere resistencia a M. oryzae, tratándose por lo tanto de miARNs que funcionan como reguladores positivos en la respuesta inmune de arroz. Por otra parte, la sobreexpresión de MIR-96, MIR-98 o MIR-203 aumenta la susceptibilidad a la infección por M. oryzae en plantas de arroz (reguladores negativos de la respuesta inmune). El análisis de mutantes de arroz afectados en la biogénesis de miARNs (mutantes dcl1, dcl3 y dcl4) indican que la producción del miARN maduro miR-64, miR-75 o miR-96 es dependiente de DCL3 y/o DCL4, lo cual apoya la idea de que se trata de nuevos miARNs de arroz. Además, mediante edición génica por CRISPR/Cas9, se ha comprobado que una delección de 22 nucleótidos en el precursor miR-75 resulta en un fenotipo de susceptibilidad a M. oryzae (Capítulo II), lo que concuerda con el fenotipo de resistencia que se observa en las plantas que sobreexpresan este miARN. En el capítulo III se ha estudiado la función de miR858 en la inmunidad innata de Arabidopsis thaliana frente a la infección por hongos patógenos. Este miARN reprime la expresión de factores de transcripción de tipo MYB que actúan como activadores de la expresión de genes que participan en la biosíntesis de flavonoides. Cuando la actividad del miR858 se encuentra bloqueada por la expresión de un gen de imitación de díana (plantas MIM858), las plantas son resistentes a la infección por hongos patógenos (Plectosphaerella cucumerina, Fusarium oxysporum f. sp. Conglutinans and Colletotrichum higginsianum), mientras que la sobreexpresión de este miARN confiere mayor susceptibilidad a la infección. Además, la interferencia con la actividad de miR858, y consiguiente aumento de la expresión de genes MYB, en las plantas MIM858 afecta de manera importante el metabolismo de fenilpropanoides, priorizándose la síntesis y acumulación de flavonoides, a expensas de la síntesis de precursores de lignina. La actividad antifúngica que se observa para kaempferol, naringenina (flavonoides) y ácido p-cumárico, explicaría el fenotipo de resistencia a la infección por hongos que se observa en las plantas MIM858. En su conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que los miARNs son componentes importantes en la resistencia/susceptibilidad a la infección por patógenos fúngicos en plantas de arroz y Arabidopsis. Un mayor conocimiento de función de miARNs en la inmunidad innata de las plantas, y de los procesos que son regulados por estos riboreguladores, puede ser de utilidad en el diseño de nuevas estrategias para el control de enfermedades en plantas.

This thesis comprises the study of miRNAs in innate immunity in plants. The work has been developed in rice (Chapter I and Chapter II) and in Arabidopsis (Chapter III), model systems used in studies of functional genomics in monocotyledonous and dicotyledonous species, respectively. Chapter I describes the functional identification and characterization of new rice miRNAs in their interaction with the fungus Magnaporthe oryzae. This fungus is responsible for blast disease, one of the most devastating diseases for rice cultivation worldwide. From the information generated by high-throughput sequencing of small rice RNA libraries, candidate sequences to represent novel rice miRNAs were selected. In this work 5 of these candidates have been studied (miR-64, miR-75, miR-96, miR-98 and miR-203). Obtaining transgenic rice lines has demonstrated that the overexpression of MIR-64 and MIR-75 confers resistance to M. oryzae, therefore these miRNAs function as positive regulators in the rice immune response. Moreover, overexpression of MIR-96, MIR-98 or MIR-203 increase susceptibility to M. oryzae in rice plants (negative regulators of immune response). Analysis of rice mutants affected in the miRNA biogenesis (dcl1, dcl3 and dcl4 mutants) indicate that the mature miRNA production of miR-64, miR-75 or miR-96 depends on DCL3 and/or DCL4, which supports the idea that they are novel rice miRNAs. Furthermore, by gene editing using CRISPR/Cas9, it has been found that a 22 nucleotides deletion in miR-75 precursor results in a susceptibility phenotype under M. oryzae infection (Chapter II), in agreement with a resistance phenotype that was observed in overexpressor plants for this miRNA. In chapter III, the miR858 function in Arabidopsis thaliana innate immunity to infection by pathogenic fungi was studied. This miRNA represses the expression of MYB transcription factors, which act as activators of the expression of genes involved in flavonoids biosynthesis. Plants are resistant to infection by pathogenic fungi (Plectosphaerella cucumerina, Fusarium oxysporum f. sp. Conglutinans and Colletotrichum higginsianum) when the activity of miR858 is blocked by the expression of target mimicry (MIM858 plants), while the overexpression of this miRNA confers greater susceptibility to infection. Additionally, interference with miR858 activity and consequent increase of MYB gene expression in MIM858 plants significantly affects phenylpropanoids metabolism, favoring the synthesis and accumulation of flavonoids, and disfavoring the synthesis of lignin precursors. The antifungal activity that was observed for Kaempferol, naringenin (flavonoids) and p-Coumaric acid, would explain the resistant phenotype by fungi infection which is observed in the MIM858 plants. Altogether, the results obtained in this work demonstrate that miRNAs are an important component in the resistance/susceptibility to infection by pathogenic fungi in Arabidopsis and rice plants. Greater knowledge of miRNA function in plant innate immunity and processes that are regulate by these riboregulators, can be useful in the design of new strategies for the control of diseases in plants.