Insights on the spatiotemporal organization of integrins and their ligands using quantitative biophysical tools

Abstract

The migration of leukocytes from the blood stream to sites of injury and infection in the extravascular tissues is fundamental for the immune response. Two of the main receptors mediating this process are the integrins aLß2 and a4ß1, both expressed on the leukocyte cell membrane, which bind to their respective ligands ICAM-1 and VCAM-1, expressed on endothelial cell (EC) membrane. The dynamic and lateral organization of integrins on the cell membrane has been shown to be crucial in the regulation of cell adhesion. Likewise, organization of ligands in small domains (clusters) would probably reinforce the bonds formed with the integrins, thus increasing leukocyte adhesion. However, how the spatiotemporal behavior of integrins and their ligands is affected by the influence of external factors, such as mechanical and/or biochemical stimuli, has not been extensively studied. In addition, the impact of such spatiotemporal changes in the process of leukocyte adhesion and migration has not been addressed yet. The main aim of this thesis has been to address these questions using a combination of state-of-art biophysical tools, including advanced cell imaging, single molecule dynamic approaches, cell mechanical stimulation, and custom-designed algorithms for data quantification. From the technical side, our general approach involved the use of single particle tracking (SPT) approaches to monitor the dynamics of individual molecules implicated in the process of the cell adhesion, in combination with different super-resolution microscopy techniques, such as STED and STORM, to visualize changes in their nanoscale organization upon the influence of biochemical and/or mechanical stimuli. To mechanically stimulate cells we developed two different approaches; namely, a mechanical stretching device and a parallel-plate flow chamber (PPFC). We integrated these devices into our single molecule set-up and succeeded in recording the diffusion of integrins on cells plated on the mechanical stretching device upon varying stress conditions. As part of this thesis, we also applied different custom-made data analysis algorithms existent in the Lab and developed novel algorithms aimed at tracking and quantifying changes in the migratory behavior of T-cells on ECs exposed to shear stress. Using this powerful palette of tools we discovered that, as a consequence of prolonged shear flow exposure, ICAM-1 undergoes a global reorganization on the EC membrane accompanied by the formation of ICAM-1 nanoclusters. These nanoclusters were found to co-localize with shear flow-induced actin-enriched patch-like structures. Moreover, we showed that T-cells migrate faster and interact for shorter period of times on ECs mechanically stimulated as compared to ECs not subjected to shear stimulation. Hence, from these results, we concluded that continuous shear flow regulates the spatial organization of cell adhesion receptors on ECs, which in turn modulates leukocyte migration. In addition, we showed that chemokine (CXCL12) stimulation leads to rapid and transient activation of the a4ß1 expressed on T cells. These changes in activation profile directly correlate with talin recruitment, restricted lateral diffusion and integrin immobilization. Moreover, co-stimulation with CXCL12 and the ligand VCAM-1 potentiated integrin immobilization. In addition, superresolution imaging revealed that the nanoscale organization of a4ß1 remains unaffected upon CXCL12 and/or VCAM-1 stimulation. Our data, thus, indicate that docking by talin of the chemokine-activated a4ß1 to the actin cytoskeleton favors integrin immobilization, which likely facilitates ligand interaction and increased adhesiveness. The overall finding of this thesis indicates that cells of the immune system respond to mechanical and biochemical stimuli by rapidly readjusting the spatiotemporal behavior of integrins and ligands on the cell membrane modulating in turn cell adhesion and migration.

La migración de leucocitos desde el torrente sanguíneo a sitios de lesión e infección es fundamental en la respuesta inmune. Dos de los principales receptores que median este proceso son las integrinas aLß2 y a4ß1, que se expresan en la membrana celular de los leucocitos y se unen a sus respectivos ligandos ICAM-1 y VCAM-1, ambos localizados sobre la membrana de células endoteliales (CE). Se ha demostrado que la dinámica y la organización lateral de las integrinas sobre la membrana celular son cruciales en la regulación de la adhesión celular. Asimismo, es muy probable que la organización de los ligandos en pequeños dominios refuerce los enlaces formados con las integrinas, fortaleciendo así la adhesión celular. Sin embargo, cómo el comportamiento espacio-temporal de las integrinas y sus ligandos es afectado por factores externos, tales como estímulos mecánicos y/o bioquímicos, no ha sido ampliamente estudiado. Además, el impacto de estos cambios espacio-temporales en el proceso de adhesión y migración leucocitaria aún no ha sido abordado. El objetivo principal de esta tesis ha sido abordar estas interrogantes usando una combinación de herramientas biofísicas de última generación que incluyen avanzadas técnicas de visualización, dinámica de moléculas individuales, estimulación mecánica de células y desarrollo de algoritmos para la cuantificación de datos. Con este fin hemos utilizado métodos de seguimiento de partículas individuales para monitorizar la dinámica de moléculas individuales, en combinación con técnicas de microscopía de super-resolución, como STED y STORM, para visualizar cambios en su organización a nano-escala tras la estimulación bioquímica y/o mecánica. Para estimular las células mecánicamente hemos desarrollado dos métodos: un dispositivo de estiramiento y una cámara de flujo de placa paralela. Ambos dispositivos fueron integrados a nuestro montaje experimental de detección de moléculas individuales y el primero fue exitosamente utilizado en la caracterización de la difusión de integrinas en células cultivadas en el dispositivo de estiramiento mecánico. Como parte de esta tesis también usamos diferentes algoritmos, existentes en nuestro grupo, para el análisis de datos y desarrollamos otros nuevos para el seguimiento y cuantificación del comportamiento migratorio de células T sometidas a flujo continuo. Utilizando estas herramientas descubrimos que, a causa de la exposición a flujo mecánico, ICAM-1 se reorganiza sobre la membrana de las CEs y forma nano-agregados. Se encontró además que estos agregados se colocalizan con regiones ricas en actina con estructura de parches. Además mostramos que las células T migran más rápido e interactúan por periodos más cortos de tiempo con CEs estimuladas mecánicamente respecto a CEs no estimuladas. De estos resultados concluimos que el flujo mecánico regula la organización espacial de los receptores de adhesión en las CEs, que a su vez modula la migración de leucocitos. También demostramos que la estimulación con quimioquinas (CXCL12) conduce a una rápida y transitoria activación de a4ß1. Estos cambios en la activación de a4ß1 se correlacionaron con el reclutamiento de talina, la inmovilización de la integrina y su reducida difusión lateral. Además, la coestimulación con CXCL12 y el ligando VCAM-1 potenció la inmovilización de a4ß1. Adicionalmente, imágenes de superresolución revelaron que la organización a nanométrica de a4ß1 no se ve afectada por la estimulación con CXCL12 y/o VCAM-1. Estos datos indican que las integrinas activadas por CXCL12 se unen al citoesqueleto por medio de talina, favoreciendo la inmovilización de a4ß1 y facilitando así, la interacción con su ligando y una mayor adhesión. En resumen, esta tesis indica que las células del sistema inmune responden a estímulos mecánicos y bioquímicos mediante el reajuste rápido de la organización espacio-temporal de integrinas y ligandos sobre la membrana celular, modulando así su adhesión y migración