Estratègies d’operació per a la producció de lipases de Rhizopus oryzae amb el fenotip Mut(s) de Pichia pastoris mitjançant substrats mixtes

Abstract

En aquest treball s’ha optimitzat el procés de producció de lipases de Rhizopus oryzae amb el fenotip Muts de Pichia pastoris mitjançant la utilització de substrats mixtes establint les condicions de procés més favorables. S’utilitza un sistema de 48 milibioreactors de 12 ml de volum amb l’objectiu d’optimitzar el procés de selecció de l’estratègia de cultiu més efectiva. Quan els cultius es realitzen utilitzant els fenotips Muts i Mut+ de P. pastoris sota promotors induïbles (AOX i FLD) s’obté un creixement deficient. La principal problemàtica recau en el sistema de condensació que presenten els milibioreactors a la part superior. S’utilitza el promotor GAP utilitzant glicerol i glucosa com a substrats, amb el que es demostra la viabilitat del sistema de 48 milibioreactors pel seguiment de bioprocessos. Posteriorment davant les avantatges que presenta la utilització de substrats mixtes en soques de fenotip Muts sota el promotor AOX, s’utilitzen sorbitol o glicerol juntament amb el metanol per observar l’efecte del cosubstrat sobre la producció de ROL. A l’utilitzar el sorbitol es realitzen cultius en semicontinu mantenint la concentració de metanol fixada en 0.5, 2 i 4 g l-1 i es manté la μ fixada en 0.01 i 0.02 h-1. S’observa que la concentració de metanol residual en el medi de cultiu és el paràmetre clau per l’optimització de la producció de ROL, trobant-se els valors màxims quan aquesta es troba fixada a 2 g l-1. A l’augmentar o bé disminuir aquesta concentració, la productivitat disminueix considerablement (2 vegades). Finalment es valida un sistema SIA per a l’anàlisi de sorbitol en línia. El sorbitol es considera un cosubstrat excel·lent però presenta una baixa μmax, fent així que el procés de producció sigui menys efectiu, si es compara amb una font de carboni alternativa. S’utilitza el glicerol com a cosubstrat, el que permetrà treballar a μ 5 vegades superiors. Es realitzen cultius en semicontinu mantenint la concentració de metanol fixada en 2 g l-1 (valor optimitzat prèviament). En aquest treball es realitzen diferents cultius on la μ es manté fixada en 0.1, 0.05 i 0.02 h-1. Es conclou que per evitar la repressió del promotor AOX la relació establerta entre les μ ha de ser inferior a 6 (μGli μMet-1), degut que al superar aquest valor s’observa una clara repressió del promotor AOX. A continuació, es decideix realitzar el canvi d’escala de les condicions més productives. Es realitzen varis cultius utilitzant el reactor a un volum inicial de treball de 30 l. Després d’estimar un favorable canvi d’escala es reprodueixen les condicions obtingudes en el millor dels processos. Durant aquest primer cultiu s’obtenen valors de productivitat volumètrica i específica 2.8 vegades inferiors als obtinguts prèviament en 5 l. Es realitzen experiments per comprovar la mescla del metanol al reactor UD50 mostrant un gradient màxim de 0.5 gMet l-1 a les diferents alçades. Es realitza una modificació al sistema d’addició del metanol, addicionant-lo de forma submergida a mitja alçada del reactor. Posteriorment els resultats milloren en un 48%, en comparació a l’addició pel capçal del reactor. Finalment es treballa amb una construcció genètica del fenotip Muts de P. pastoris que inclou la coexpressió del gen HAC1. Es treballa amb 2 soques, la primera coexpressa el gen HAC1 de forma induïble sota el promotor AOX i la segona ho realitza de forma constitutiva sota el promotor GAP. Quan s’utilitza la soca que coexpressa el gen de forma induïble, es troben millores significatives (augment de 1.5 vegades de la productivitat) al realitzar una estratègia amb substrats mixtes (sorbitol i metanol) a les condicions prèviament optimitzades. Quan s’utilitza la soca que coexpressa el gen de forma constitutiva, no es presenten millores en el procés de producció.

The objective of this thesis was to optimize the production of Rhizopus oryzae lipase in fed-batch mixed substrate conditions with a Pichia pastoris Muts strain. A milibioreactors bloc of 48 reactors with 12 ml working volume was tested to optimize the culture conditions under fed-batch strategy. When Mut+ and Muts phenotypes were used under AOX and FLD promoters, no satisfactory growth was observed, related with a deficiency presented by the cooler system allowing a lose of methanol of 0.5 gMet l-1 h-1. However, when Pichia pastoris under the constitutive promoter GAP was used, satisfactory growth was observed obtaining similar values than the ones obtained at higher volumes (5 l). In conclusion the 48 milibioreactors bloc represents an excellent tool to optimize the ROL production under GAP promoter, although was not satisfactory under AOX and FLD promoters. Subsequently to the advantage of using mixed substrates in place of using methanol as a sole carbon source, some experiments were done to optimize the ROL production under fed-batch conditions using sorbitol and glycerol as cosubstrats. When sorbitol was used the specific growth rate was maintained on 0.01 i 0.02 h-1 by a preprogrammed exponential feed. Methanol set-point concentration was maintained on 0.5, 2 i 4 g l-1 controlled by a predictive algorithm. Lipolytic activity, yields, productivity and specific productivity, but also specific growth, consumption and production rates were analyzed showing that the best values were reached when methanol concentration was fixed on 2 g l-1 showing an important reduction when this set-point was increased or decreased, independently of the specific growth rate used. The experiments showed that the key parameter was the set-point of methanol. On the other hand the specific growth influence was not representative. Finally a SIA analyser of sorbitol was tested. Sorbitol is considered an excellent cosubstrat but this low μmax in comparison with other possible cosubstrats, assures low productions. Different experiments using glycerol as cosubstrat were made at a constant methanol set-point of 2 g l-1, at three different glycerol feeding rates to assure a constant specific growth rate of 0.02, 0.05 and 0.1 h-1, by means of a pre-programmed exponential feeding rate strategy. The best production values were reached at the lowest specific growth rate tested. With Muts phenotype glycerol could not increase the productivity of the process comparing with sorbitol due to inhibitory effect on methanol consumption and recombinant lipase production. The specific growth relation must be fixed lower than 6 (μGli μMet -1), to avoid AOX promoter repression. The scale-up of the most effective process was done using a Biostat UD50 (30 l working volume). Methanol concentration was fixed on 0.02 h-1 and the specific growth rate was fixed on 0.02 h-1 by a sorbitol pre-programmed exponential feed. An encouraging scale-up was assumed (better KLa and similar geometry), although the first feed-batch cultivations under this conditions did not reproduced the values obtained under lab scale (5 l). Problems were related to the unsuccessful distribution (maximal gradient was 0.5 gMet l-1) of the substrates along the different height of the reactor. Methanol addition was submerged to the half height of the reactor to improve substrate distribution along the reactor. Feed-batch cultivation was done, and ROL production values were increase about 48%, in comparison with result obtained when methanol was added by the reactor headspace. And important increase was obtained, but is still necessary further research to reproduce values obtained in lab-scale. Finally a new Pichia pastoris strain construction co-expressing constitutively and inductively HAC 1 gene was used to optimize ROL production. Feed- batch cultivations were done using methanol and sorbitol as cosubstrats under the same conditions previously optimize (methanol concentration on 2 g l-1 and μ on 0.02 h-1). When inductively co-expression was used important improvements were obtained on productivity and specific productivity. On the other hand, when constitutively coexpression was used, inferior production values were obtained in comparison with results obtained with the non engineered strain.