Càncer colorectal i gen supressor tp53: estudi comparatiu entre metodologies

Abstract

La pèrdua de 17p13 succeeix en més del 70% dels tumors colorectals, i sòl acompanyar-se de mutació al locus TP53 de l'al·lel concomitant. A banda, hi ha prou indicis per a recolzar la hipòtesi que p53 és un marcador de pronòstic d'aquest tipus de tumors.<br/>A manca de consens sobre la millor estratègia per a conèixer el seu estat -no hi ha estàndard d'or-, ens proposàrem com a objectiu trobar un protocol aplicable a l'estudi rutinari de la proteïna p53 en el càncer colorectal. Per això, seleccionarem una sèrie prospectiva de casos d'adenocarcinoma primari, obtinguts per resecció quirúrgica, i d'ells recollirem, a banda dels resultats de la immunohistoquímica (IHQ) de p53, un seguit de dades clinicopatològiques: edat, sexe, mida del tumor, grau histològic, infiltració, afectació ganglionar i estadi clínic. Característiques demogràfiques de la sèrie foren: 100 tumors pertanyent a 96 pacients (38 dones i 58 homes), amb edat de presentació entre 37-93 anys. Els paràmetres obtinguts es resumeixen en: mida mitja dels tumors 4'1 cm, el 51% amb afectació ganglionar, grau histològic predominant moderadament diferenciat o grau 2 (81%) i nivell d'infiltració majoritari pT3 (72%).<br/>De l'abordatge IHQ en resultà que el 56% dels tumors evidencià acumulació de p53 (llindar de sensibilitat: 10%), mentre que un 29% dels casos negatius presentà manca total d'immunopositivitat. L'estudi del genotip, mitjançant PCR-SSCP/seqüenciació (exons 4-8), posà de manifest la presència de mutacions en el 68% dels tumors, el 73% de les quals conservaren la pauta de lectura. En analitzar les discrepàncies entre les 2 aproximacions concloguérem que el 39% dels casos fenotípicament negatius contenia mutacions al gen TP53, el que representa un 17% del total. Per contra, el 5% resultà mancat de mutacions -al menys, en els exons estudiats- malgrat presentar acumulació nuclear de p53. La representació mitjançant corba ROC dels resultats d'IHQ permeté afirmar que la tècnica s'ajusta a la de referència (SSCP/seqüenciació) en el càncer colorectal, amb una àrea sota la corba -equivalent de la precisió- del 79%. La regressió logística situà el llindar de sensibilitat òptim per a la IHQ en el 15%, percentatge en el qual es compensen millor els errors falsos, positius i negatius.<br/>La detecció de LOH del microsatèl·lit intragènic p53CA posà de manifest que el 63% dels tumors tenia pèrdua del locus TP53. L'anàlisi estadística demostrà una presència superior de mutacions en els tumors que havien perdut l'al·lel normal concomitant, i que els tumors d'estadi superior -en presència d'afectació ganglionar- tendien a presentar pèrdues de 17p.<br/>Conclusions: 1) la IHQ és un mètode vàlid per a cribrar alteracions de p53 en el càncer colorectal, malgrat requereixi ésser complementat amb estudis de SSCP/seqüenciació en els tumors de fenotip negatiu (llindar de sensibilitat: 15%); 2) el protocol d'aproximació a l'estat de p53 ha d'incloure la detecció de LOH al locus TP53.

More than 70% of colorectal adenocarcinomas exhibit 17p13 allelic losses, which usually occur with mutation at the TP53 locus of the concomitant allele. There are also studies that suggest that p53 is a prognostic marker for this type of tumors.<br/>Since there is no consensus about which is the best approach to assess p53 status -no gold standard has been defined, yet-, we undertook our study to establish a protocol suitable for the routine assessment of this marker in colorectal cancer. With this purpose, we selected a prospective series of primary adenocarcinomas, obtained by surgical resection and from them we compiled, apart from their p53 immunohistochemical results, the following clinicopathological data: age, sex, tumor size, histological grade, degree of invasion, nodal involvement and staging. Demographics of our series were: 100 tumors belonging to 96 patients (38 women and 58 men), 37-93 years of age at tumor presentation. Other parameters can be synthesized as: mean size of tumors 4.1 cm, 51% with nodal involvement, a prevalence of moderately differentiated tumors or grade 2 (81%), and the majority of tumors with pericolic fat invasion or pT3 (72%). <br/>The IHC approach allowed the detection of 56% of tumors with p53 protein accumulation (cutoff value: 10%), while up to 29% of the negative cases showed no immunopositivity at all. Genotype studies performed by PCR-SSCP/sequencing (exons 4-8) evidenced the presence of mutations in 68% of tumors, 73% of which preserved their gene reading frame. When discrepancies between the two approaches were analyzed, it was realized that 39% of the phenotypically negative cases were mutated at the TP53 gene, which represents 17% of total cases. On the contrary, 5% of tumors presenting nuclear accumulation of p53 protein resulted to be exempted of mutations, at least in the studied exons. The plot of IHC results by a ROC curve let us determine that this technique fitted to the reference one (SSCP/sequencing) for colorectal carcinoma, being the area under the curve -equivalent to accuracy- of 79%. Logistic regression established the optimal cutoff value at 15%, percentage at which false positive and negative errors are best balanced.<br/>Detection of LOH using the intragenic p53CA dinucleotide microsatellite revealed that 63% of tumors had allelic loss at the TP53 locus. Statistical analyses demonstrated a superior presence of mutations in tumors that had lost its wildtype concomitant allele, and also that tumors with higher staging, based on nodal involvement, tended to present 17p allelic loss.<br/>Conclusions: 1) IHC is a valid method to screen p53 alterations in colorectal cancer, although it is necessary that negative tumors (cutoff value: 15%) are also complemented by SSCP/sequencing. 2) A protocol to assess p53 status must include the detection of LOH at the TP53 locus.