Actividad in vitro de Oxaliplatino asociado a otros fármacos y demostración de la reversión de la resistencia a 5-Fluorouracilo

Abstract

Durante más de 40 años el 5-Fluorouracilo (5-FU), inhibidor de la Timidilato Sintasa (TS), ha sido la terapia estándar en el tratamiento del cáncer colorrectal (CCR). Uno de los principales obstáculos en el tratamiento es la resistencia a quimioterapia. Numerosos estudios demuestran que la resistencia a 5-FU es un evento multifactorial que incluye alteraciones en el transporte, el metabolismo, la diana terapéutica, el ciclo celular y los mecanismos de apoptosis. La sobreexpresión del gen TS correlaciona clínicamente con la resistencia a 5-FU. En el presente estudio se generaron dos líneas resistentes a 5-FU (HT29-5FUR y LoVo-5FUR) por exposición continuada a dosis creciente del fármaco. Dichas líneas presentaron un patrón del ciclo celular y tiempos de duplicación comparables a los de sus homólogas sensibles (HT29 y LoVo, respectivamente). Mostraron entre 5 y 3 veces más resistencia a 5-FU que sus correspondientes homólogas sensibles. No se hallaron diferencias en la sensibilidad de estas líneas al Oxaliplatino (OXA). En cambio, la línea LoVo-5FUR mostró un patrón de resistencia cruzada a Inhibidores de la Topoisomerasa I (TPT, C PT-11 y SN38). La adaptación de las líneas al 5-FU no alteró el estado de la p53 ni el fenotipo de errores de replicación (RER). El fenotipo de resistencia a 5-FU en estas líneas correlacionó con la sobreexpresión de TS (ARNm y proteína) aunque no se observó un proceso de amplificación génica. El análisis genómico comparativo (CGH) mostró la existencia de anormalidades genéticas (ganancias/pérdidas) en las líneas resistentes a 5-FU comparadas a sus respectivas homólogas sensibles que podrían estar potencialmente implicadas en la adquisición de la resistencia a 5-FU.<br/>El Oxaliplatino y los inhibidores de Topoisomerasa I (TPT y CPT-11) son agentes citotóxicos con actividad antitumoral en el CCR. En el presente estudio, también se evaluó la citotoxicidad de las asociaciones entre OXA y 5-FU o TPT en un panel de líneas celulares derivadas de tumores colorrectales sensibles (HT29, LoVo, DLD-1 y LS-513) y resistentes a 5-FU (HT29-5FUR y LoVo-5FUR). Asimismo se analizó la expresión de TS (ARNm y proteína) y Topoisomerasa I (Topo I; ARNm) tras la exposición a OXA como parámetros directamente relacionados con la sensibilidad al 5-FU e inhibidores de Topo I respectivamente, en las parejas sensibles/resistentes. Los esquemas secuenciales analizados fueron: OXA(4h)®5-FU(24h); 5-FU(24h)®OXA(4h); OXA(4h)®TPT(24h); TPT(24h)®OXA(4h) y OXA(4h)®5-FU (5 días a las dosis a las que se indujo la resistencia en las parejas sensible/resistente). Todas las combinaciones resultaron sinérgicas a dosis moderadas de ambos fármacos, únicamente la asociación 5-FU®OXA en la línea LoVo-5FUR resultó aditiva para cualquier fracción de inhibición. La sinergia fue además independiente del fenotipo de resistencia a 5-FU, del estado del sistema reparador del ADN y/o del estado de p53. La exposición previa a OXA en los esquemas OXA®5-FU y OXA®TPT permitió reducir las dosis de 5-FU y TPT en combinación en las líneas resistentes hasta niveles similares a los requeridos por las correspondientes líneas sensibles, revirtiendo el fenotipo de resistencia a 5-FU y permitiendo en el caso de la línea LoVo-5FUR sobrepasar el fenotipo de resistencia cruzada a Inhibidores de Topo I. La exposición a OXA, administrado como agente único provoca una caída de los niveles de TS (ARNm y proteína) en todas las líneas celulares analizadas. Durante la exposición a 5-FU se observó una sobreexpresión de los niveles de TS en todas las líneas celulares, aunque este incremento fue mucho menor en el esquema OXA®5-FU (entre 3 y 5 veces) comparado con el obtenido para la exposición a 5-FU como agente único. Estos resultados correlacionaron con la actividad sinérgica observada para la asociación OXA®5-FU. La exposición previa a OXA también indujo una disminución en los niveles de expresión de Topo I que correlacionó con la disminución en la dosis de TPT en la combinación OXA®TPT. Estos resultados también sugieren que la administración de los inhibidores de Topo I debe ser previa al OXA ya que los niveles disminuidos de Topo I es uno de los principales mecanismos de resistencia a este tipo de fármacos. Finalmente demostramos que la citotoxicidad observada en las asociaciones entre OXA y 5-FU no correlaciona con un incremento en los procesos apoptóticos. En conclusión, el presente estudio in vitro permite ampliar el conocimiento de las bases moleculares de la actividad de las asociaciones de 5-FU e inhibidores de Topo I y derivados platinados. La disminución en los niveles de TS tras la exposición a OXA en el esquema OXA/5-FU proporciona una nueva interpretación al sinergismo observado en esta asociación tanto en tumores sensibles como resistentes a 5-FU. Por otro lado, la combinación OXA/Inhibidores de Topo I representa una alternativa para el tratamiento del CCR avanzado.

Over more than 40 years, 5-Fluorouracil-based chemotherapy has been the standard treatment of colorectal cancer (CRC). Chemotherapy resistance is an important cause of cancer treatment failure. 5-Fluorouracil (5-FU) inhibits Thymidylate Synthase (TS) enzyme. Overexpression of Thymidylate Synthase (TS) has been correlated to 5-FU-resistance Several studies have also indicated that 5-FU resistance may be due to a multiple genetic pathways which includes transport mechanisms, metabolism, molecular mechanism, cell cycle kinetics and protection from apoptosis. At the present work, two 5-FU-resistant cell lines (HT29-5FUR and LoVo-5FUR) were established from sensitive parental cell lines (HT29 and LoVo, respectively) by stepwise with increasing concentrations of 5-FU. Cell cycle distributions and doubling times were barely equivalent in both, sensitive and 5-FU-resistant cell lines. 5FU-resistant cell lines exhibit about a 5-fold and 3-fold increase in resistance to the drug as compared to parental cell lines. No differences in sensitivity towards Oxaliplatin were found between sensitive/5-FU-resistant cells. Interestingly, LoVo-5FUR cell line show a cross-resistance pattern to Topoisomerase I inhibitors (TPT, CPT-11 and SN38). 5-FU adaptation does not alter p53 status or RER phenotype in these cell lines. Cellular resistance to 5-FU correlated with an increase in TS gene expression (ARNm and protein), although no gene amplification was observed. Comparative genomic hybridisation (CGH) analysis revealed several genetic abnormalities (gains/loss) in 5-FU-resistant cells as compared to corresponding parental cell lines that could be potentially related with 5-FU resistance phenotype. <br/>Oxaliplatin (OXA) and DNA Topoisomerase I inhibitors (TPT, CPT-11) are cytotoxic agents with proven clinical antitumor activity in CRC. At the present work, we also studied the cellular pharmacology of OXA in combination with 5-FU or TPT in a panel of sensitive (HT29, LoVo, DLD-1 and LS-513) and 5-FU-resistant human colon cancer cells (HT29-5FUR and LoVo-5FUR). Moreover, we evaluated TS (mRNA and protein) and Topoisomerase I (Topo I; mRNA) expression after OXA exposure as parameters directly related to sensitivity to 5-FU and Topo I inhibitors respectively, in sensitive/resistant cell lines. Sequential combination schedules used were: OXA(4h)®5-FU(24h); 5-FU(24h)®OXA(4h); OXA(4h)®TPT(24h); TPT(24h)®OXA(4h) and OXA(4h)®5-FU(5-days exposure at the 5FU dose used for the induction of 5FU-resistance phenotype). All sequential associations were synergistic at moderate doses of both drugs in all cell lines tested, only 5-FU®OXA combination was additive in LoVo-5FUR cells to all inhibition fraction. The synergism found was independent from 5-FU-resistant phenotype, mismatch repair system or p53 status. Previous exposure to OXA in OXA®5-FU and OXA®TPT schedules reduced doses of 5FU and TPT given in combination at the resistant cell lines until levels similar to that obtained in corresponding sensitive cell lines suggesting the role of Oxaliplatin in the overcoming of 5-FU resistance phenotype and in the abrogation of the cross-resistance pattern to Topo I inhibitors showed by LoVo-5FUR cells. The exposure to OXA as single agent induced a significant decrease in TS levels (mRNA and protein) in all cell lines. We have also observed that sequential administration of OXA/5-FU induced a significant decrease in TS mRNA expression (between 3 and 5-fold) as compared to exposure to 5-FU as a single agent in both, sensitive and 5FU-resistant cell lines. These results correlated with the synergistic activity observed in sequential OXA/5-FU administration schedule. Previous exposure to OXA also induced a down-regulation of Topo I gene expression that correlates with the decrease of TPT doses in OXA®TPT combination schedule. These results also suggest that Topo I inhibitors should to be administered previous to OXA, as diminished Topo I levels is one of the most important cause of resistance to these agents. Finally, we demonstrated that despite the high level of cytotoxicity found in the associations between OXA and 5-FU, no increases in apoptosis were observed. In conclusion, our in vitro findings contribute to a better knowledge of the combination of 5-FU or Topo I inhibitors and platinum derivatives, contributing to a rationale for the optimal clinical development of the association between these agents. Down-regulation of TS due to OXA exposure in OXA/5-FU schedules promote a new interpretation of the synergistic activity observed in sensitive and 5-FU-refractory tumours. By other hand, combination of OXA/Topoisomerase I inhibitors represent an alternative for the treatment of advanced colorectal cancer.