Proteome characterization of Brachyspira strains. Identification of bacterial antigens

Abstract

El género Brachyspira incluye varias especies patogénicas que afectan a cerdos, perros, pájaros y humanos. En cerdos, Brachyspira (anteriormente Serpulina y Treponema) hyodysenteriae y Brachyspira pilosicoli son patógenos intestinales bien conocidos. Estas especies son espiroquetas gram-negativas, flageladas y anaeróbicas, las cuales viven en el intestino grueso y que tienen una asociación estrecha con la mucosa del colon. Brachyspira hyodysenteriae es el agente causante de la disentería porcina, mientras que Brachyspira pilosicoli está relacionada con la espiroquetosis intestinal, una colitis más leve, no hemorrágica. La disentería porcina es una enfermedad con un impacto importante en la producción porcina debido a los costes vinculados a la mortalidad, morbididad, la producción ineficiente y la medicación de los animales. Aunque la enfermedad puede afectar animales de todas las edades, afecta raramente a lechones menores de tres semanas, produciéndose más frecuentemente durante los periodos de crecimiento y finalización, lo cual agrava las pérdidas económicas. Las estrategias para tratar estas enfermedades se basan principalmente en el uso de antibióticos como Tiamulin, Valnemulin, Tylosin, Tylvalosin o Lincomycin. Desafortunadamente, cepas resistentes a antibióticos han sido detectadas para ambas especies en diferentes países alrededor del mundo. A pesar de que hace mucho tiempo que se conoce el hecho de que los cerdos que se recuperan de una infección desarrollan Resistencia contra Brachyspira hyodysenteriae, no hay una vacuna disponible todavía. Los genomas de estas especies están disponibles desde los años 2009-2010, pero la información a nivel proteómico todavía es escasa. En este trabajo se presenta la caracterización de los proteomas de estos patógenos. Se proporciona evidencia experimental del perfil de expresión proteica en estas especies, incluyendo PTMs y SAS, y se ha llevado a cabo en el contexto de la búsqueda de potenciales candidatos para elaborar una vacuna. Esta caracterización se ha llevado a cabo a través del estudio del proteoma total, el proteoma expuesto y el inmunoproteoma de cepas comerciales y aislados de estas especies. - El proteoma total fue estudiado a través de una aproximación proteómica shotgun, usando una serie de herramientas informáticas dirigidas a optimizar la cantidad de información sobre la secuencia obtenida de los datos espectrométricos. En una primera etapa, los espectros fueron analizados con una combinación de seis motores de búsquedas diferentes usando la aplicación PeptideShaker. Aquellos espectros que no se identificaron en esta primera etapa fueron analizados con una combinación de novo y búsqueda en base de datos con motor de búsqueda usando la aplicación PEAKS. Las secuencias que no se identificaron después de esta etapa se buscaron en BLAST frente a base de datos de Brachyspira total y de mamíferos. En resumen, más de 1500 proteínas fueron identificadas para cada especie. La cobertura del proteoma estimada fue 67-70%. Además, se ha descrito el perfil de PTM, siendo la metilación la modificación más frecuente. A través del enriquecimiento especifico se identificaron 79 y 91 sitios de fosforilación, y 3221 y 5579 sitios de acetilación para B. hyodysenteriae y B. pilosicoli, respectivamente. - El proteoma expuesto fue estudiado usando sobrenadantes celulares y muestras obtenidas después de un tratamiento enzimático controlado de las células intactas. Entre las proteínas más abundantes identificadas en el proteoma expuesto hay proteínas relacionadas con movimiento/chemotaxis, proteínas ribosomales, enolase, NADH oxidasa, y Heat Shock Proteins. - El inmunoproteoma fue caracterizado por immunoblot de las proteínas de bacteria con suero de cerdos experimentalmente infectados. Se identificaron once proteínas inmunoreactivas para B. hyodysenteriae y 8 para B. pilosicoli. Dos de estas proteínas, enolase y PEPCK fueron identificadas como inmunoreactivas en las dos especies.

The genus Brachyspira includes several pathogenic species affecting pigs, dogs, birds and human. In pigs, Brachyspira (formerly Serpulina and Treponema) hyodysenteriae and Brachyspira pilosicoli are well known intestinal pathogens. These species are flagellated, anaerobic, gram negative spirochetes which inhabit the large intestine and have an intimate association with the colonic mucosa. Brachyspira hyodysenteriae is the causative agent of Swine dysentery, while Brachyspira pilosicoli is associated with Intestinal spirochetosis, a milder, non–haemorrhagic colitis. Swine dysentery is a disease with an important impact on pig production due to the costs associated with mortality, morbidity, inefficient production and medication of the animals. Although the disease can affect animals of all ages, it is rarely detected in piglets younger than three weeks old; occurring more frequently during growing/finishing periods, which aggravates the economic losses. Strategies to treat these diseases rely mainly in the use of antibiotics such as Tiamulin, Valnemulin, Tylosin, Tylvalosin or Lincomycin. Unfortunately, antibiotic resistant strains have been detected for both species in many countries around the world. Despite it is long been known that pigs generate resistance against B. hyodysenteriae after recovering from infection, no vaccine is available yet. The genomes of these species are available since 2009-2010 but proteome information is still scarce. In this work, a large-scale characterization of the proteomes of these pathogens is presented. The work provides experimental evidence of the protein expression profile in these pathogens, including PTMs and SAS and is carried out in the context of the search for potential vaccine candidates. This characterization has been performed through the study of the total proteome, the exposed proteome and the immunoproteome of commercial and environmental strains of these species. - The total proteome was studied through a shotgun proteomics strategy, using a range sofware tools directed to optimize the amount of sequence information extractable from the spectrometric data. In a first stage, spectra were analysed with a combination of six different search engines using the PeptideShaker application. Unmatched spectra were analysed by a combination of de novo and database search engines using the PEAKS application. Unmatched sequence tags after this stage were further BLASTed against Brachyspira and mammals databases. Overall, more than 1500 proteins were identified for each species. The estimated proteome coverage was 67-70%. In addition their PTM profile was described, being methylation the more frequent modification. Specific enrichment allowed identification of 79 and 91 phosphorylation sites and 3221 and 5579 acetylation sites for B. hyodysenteriae and B. pilosicoli, respectively. - The exposed proteome was studied using cell culture supernatants and samples obtained after a controlled enzymatic treatment of intact cells. Among the most abundant exposed proteins are proteins related to movement/chemotaxis, ribosomal proteins, enolase, NADH oxidase and Heat Shock Proteins. - The immunoproteome was characterized immunoblotting the bacterial proteins with sera from challenged pigs. Eleven immunoreactive proteins for B. hyodysenteriae and 8 for B. pilosicoli were identified. Two of these proteins, enolase and PEPCK, were found immunoreactive in the two species.