EPHA2 com a diana terapèutica pel sarcoma d'Ewing

Abstract

El sarcoma d’Ewing (SE) és el segon tumor ossi més freqüent en nens i adults joves, i presenta una incidència d’un màxim de 5 casos per milió en adolescents. Una de les característiques principals del SE és la seva gran capacitat metastàtica, aproximadament un 30 % dels casos en el moment del diagnòstic. Aquest fet és especialment greu ja que fa caure la taxa de supervivència fins a un 20 %. A nivell molecular, el SE es caracteritza per la presència d’una translocació cromosòmica que, en la majoria dels casos, dóna com a resultat la proteïna de fusió EWS/FLI1. La proteïna de fusió actua com a factor de transcripció aberrant i esdevé el promotor de la malaltia, controlant processos tan diversos com la transformació o la resistència a quimioteràpia. Una altra molècula que contribueix a la patogènesi és el receptor de membrana EPHA2. El nostre grup de recerca va descriure prèviament que EPHA2 s’expressa àmpliament en pacients de SE i que té un paper clau en el procés d’angiogènesi en aquests tumors. A més, aquest receptor també es troba sobreexpressat en altres tumors com els de pàncrees o ovari i ha estat implicat en la majoria de processos de malignitat tumoral. EPHA2 pertany a la família de receptors tirosina quinasa, essent el seu lligand principal la Efrina-A1. No obstant, les característiques pro-oncogèniques d’EPHA2 han estat relacionades amb les funcions independents del seu lligand, i està descrit que aquestes depenen de la fosforilació de la serina 897 del receptor. La presència d’un receptor de membrana que es troba sobreexpressat en les cèl·lules tumorals i l’existència d’una proteïna de fusió que està directament relacionada amb l’inici i progressió del SE, suggereixen la idea de desenvolupar una teràpia dirigida per aquests tumors. Per això, es va proposar el disseny d’una quimera que constava d’un ARNi contra EWS/FLI1, unit a un aptàmer específic per EPHA2. Els aptàmers són molècules d’ADN o ARN, seleccionades pel mètode SELEX, capaces de reconèixer una molècula diana amb una elevada afinitat i especificitat. En els últims anys, s’han posicionat com una eina molt prometedora, ja que després de reconèixer un marcador a les cèl·lules diana, són capaços d’alliberar diferents substàncies citotòxiques dins les cèl·lules. El conjunt de resultats d’aquest treball demostren que EPHA2 es troba fosforilat en el residu S897 en un panell de línies de SE i que aquesta fosforilació depèn de la via de les MAPK. De forma consistent, la sobreexpressió estable d’EPHA2 en cèl·lules amb nivells baixos del receptor va promoure la proliferació i la migració cel·lular. A més, el silenciament d’EPHA2 en dues línies de SE va reduir la capacitat tumorígenica, la migració i la invasió cel·lular in vitro, així com també la incidència de metàstasis pulmonars en dos models de metàstasi in vivo, un experimental i un altre ortotòpic. Per analitzar més profundament l’efecte del silenciament d’EPHA2 en cèl·lules de SE, es va realitzar un microarray d’expressió gènica. Les anàlisis funcionals van revelar una implicació d’aquest receptor en senyalització, motilitat i supervivència cel·lular. Tanmateix, l’estudi d’EPHA2 en un altre sarcoma pediàtric va reproduir el paper oncogènic del receptor i la seva regulació mitjançant la via de les MAPK. Globalment, aquests resultats evidencien que EPHA2 i els seus efectors poden ser noves dianes a estudiar per la teràpia contra el SE. De fet, aptàmers seleccionats contra EPHA2 van revertir la seva funció oncogènica en termes de proliferació i migració cel·lular. De forma paral·lela, aquests aptàmers també van resultar efectius per alliberar un ARNsi contra EWS-FLI1 a l’interior de les cèl·lules de SE. Així, els resultats serveixen com a prova de concepte que l’ús d’aptàmers contra EPHA2 és una aproximació factible per alliberar substàncies citotòxiques a les cèl·lules de SE. Conjuntament, la inhibició d’EPHA2 i EWS-FLI1, podria aportar benefici terapèutic en un futur pels pacients de SE on el tractament convencional no resulta efectiu.

Ewing sarcoma (ES) is the second most common bone malignancy affecting mostly children and young adults. Aggressive manifestation of ES, largely in the form of metastasis, portends poor survival for these patients. ES is characterized by a chromosomal translocation between EWS and FLI1 genes. The resulting fusion protein acts as an aberrant transcription factor and becomes the principal driver of this tumor. EPHA2 is a tyrosine kinase receptor that is overexpressed in a wide variety of tumors and correlates with the malignant phenotype. Accordingly, our group previously described the implication of EPHA2 receptor in promoting angiogenesis in ES cells via ligand-dependent signaling. Otherwise, EPHA2 ligand-independent activity, controlled upon phosphorylation at serine 897 (S897), has been linked to metastasis in several types of cancer. In this context, we propose to develop a new targeted therapy consisting of an RNA aptamer against EPHA2 linked to a siRNA against EWS/FLI1. Here, we report that EPHA2 receptor is phosphorylated at S897 in a panel of ES cell lines, suggesting a potential role for EPHA2 in ES oncogenic progression. Consistently, stable overexpression of EPHA2 in ES cells enhanced proliferation and migration. Moreover, silencing of EPHA2 in two different ES cell lines resulted in reduced tumorigenicity, inhibition of migration and invasion capacities of ES cells in vitro, and reduction in the lung metastasis incidence in experimental and spontaneous metastasis assays. To further study the effect of EPHA2 silencing in ES cells, we performed a genome-wide gene expression microarray. Ingenuity pathway analysis revealed the implication of this receptor in cell signaling, cellular movement, and survival. Altogether, our results suggest that EPHA2 expression correlates with aggressive behavior in ES. In fact, EPHA2 aptamers reversed its aggressive function in terms of cellular migration and proliferation. Moreover, a multifunctional molecule aptamer-siRNA was useful for EWS/FLI1 silencing. Altogether, blocking EPHA2 function and EWS/FLI1 expression may be promising for the treatment of ES.