Immunotherapy for alzheimer’s disease: from antibody engineering to combined therapy with apolipoproteins.

Abstract

ScFv-h3D6 és un fragment variable de cadena lleugera, derivat de l’anticòs bapineuzumab, capaç d’evitar la citotoxicitat induïda pel pèptid Aβ, retirant els oligòmers de la via amiloide cap a una via d’agregació worm-like (WL). A més, s'ha demostrat que és eficaç a nivell cognitiu, cel·lular i molecular en el tractament del model murí d’Alzheimer 3xTg-AD. Tot i el seu gran potencial, la producció del scFv-h3D6 estava limitada per alguns colls d'ampolla com la presència de conformacions scrambled i la seva contaminació amb endotoxines, que reduïen el rendiment de producció i n’augmentaven el cost. En el present treball, diverses formes per millorar la producció i l'estabilitat termodinàmica han estat explorades. En primer lloc, els ponts disulfur s'han eliminat per tal d'evitar conformacions scrambled i, d'aquesta manera, millorar el rendiment de purificació de la proteïna, assegurant una conformació homogènia. L’eliminació del pont disulfur del domini més estable, va resoldre el problema de l’scrambled, duplicant el rendiment de producció. També es va canviar la ruta d'agregació des de la morfologia de protecció WL a una amiloide. Després, es va estabilitzar el scFv-h3D6 mitjançant la introducció de la mutació VH-K64R i combinant-la amb l'extensió anteriorment descrita (C3). Les estabilitats de les diferents construccions del scFv-h3D6 van resultar en l'ordre C3> K64R / C3> VH-K64R ≥ scFv-h3D6, demostrant que la combinació d'ambdues mutacions no era additiva sinó que es cancel·laven parcialment entre si. En els assajos de citotoxicitat, tots els mutants evitaven la citotoxicitat del pèptid Aβ d'una manera dependent de la dosi i amb eficiències que es correlacionaven amb l'estabilitat. Finalment, es va realitzar un canvi en el sistema d'expressió del scFv-h3D6: d’Escherichia coli a Pichia Pastoris. A més de mantenir les mateixes propietats termodinàmiques, es van millorar d’altres: homogeneïtat de la mostra, l'absència de conformacions scrambled, mostra lliure d'endotoxines, un millor rendiment i fàcil extrapolació a una escala més gran. L'eficàcia terapèutica es va demostrar in vitro i in vivo. D'altra banda, la immunoteràpia contra el pèptid Aβ ha estat molt estudiada, però no com altres molècules implicades en la malaltia d’Alzheimer poden afectar al rendiment de l'anticòs. Per entendre completament les possibles interaccions i efectes entre Aβ, scFv-h3D6, apoE i apoJ; es va realitzar un estudi complet des de diferents perspectives: biofísica, cel·lular i in vivo. Enlloc d'apolipoproteïnes senceres, es va combinar el scFv-h3D6 amb els pèptids mimètics (MP) de les apolipoproteïnes (apo) E i J, compostos d'estructures essencials per a la unió a altres molècules. Els estudis biofísics van mostrar que el apoE-MP impedia la formació de les fibres WL pel complex scFv-h3D6/Aβ i parcialment interferia en la reducció induïda per scFv-h3D6 en la captació d’Aβ pels astròcits; mentre que el apoJ-MP permetia la formació de fibres WL i no interferia en la captació d’ Aβ. En mirar la inflamació associada amb l'Alzheimer, el apoE-MP va desenvolupar un paper antiinflamatori en cultiu cel·lular i en el model de ratolí 3xTg-AD; mentre apoJ-MP va mostrar un perfil antiinflamatòri només quan es combinava amb scFv-h3D6. ScFv-h3D6 sol no va induir l'activació microglial, prèviament observada amb anticossos complets, sinó més aviat la va reduir. Els nivells d’apoE i J es van reduir amb el scFv-h3D6, però van augmentar amb apoE-MP i apoJ-MP. Com a conclusió general, el tractament amb scFv-h3D6 disminueix la càrrega d’Aβ, disminueix la captació d’ Aβ en astròcits, restaura els nivells de apoE i apoJ endògens i redueix la inflamació. Encara que la teràpia combinada amb MPs s'ha d'analitzar més, aquest treball demostra que tots els efectes del scFv-h3D6 estan dirigits a prevenir la patologia de l’Alzheimer, sense provocar els efectes perjudicials que es mostren amb el bapineuzumab en assajos clínics.

ScFv-h3D6 is a single chain variable fragment derived from the monoclonal antibody bapineuzumab that prevents Aβ-induced cytotoxicity by withdrawing Aβ oligomers from the amyloid pathway towards the worm-like one. In addition, it was shown to be effective at the behavioral, cellular, and molecular levels in the treatment of the mouse model of Alzheimer’s disease (AD) 3xTg-AD. Although its great potential, scFv-h3D6 production was limited by some bottlenecks like the presence of scrambled conformations generated in the refolding process and its contamination with endotoxins, which dramatically reduce the production yield and increase the cost. In the current work, several ways to improve protein production and thermodynamic stability have been explored. Firstly, disulphide bridges were eliminated to avoid scrambled conformations and, in this way, improve the protein purification yield and assure an homogenous protein conformation. Elimination of the disulphide bridge of the most stable domain, VH, solved the scrambling problem and doubled the production yield. Notably, it also changed the aggregation pathway from the protective worm-like morphology to an amyloid one. Then, we have stabilized the scFv-h3D6 fold by introducing the mutation VH-K64R and combining it with the previously described elongation of the VL domain (C3). The stabilities of the different scFv-h3D6 constructs resulted in the order C3 > K64R/C3 > VH-K64R ≥ scFv-h3D6, showing that combination of both mutations was not additive but rather they partially canceled each other. Cytotoxicity assays showed that all the mutants recovered cell viability of Aβ-treated neuroblastoma cell cultures in a dose-dependent manner and with efficiencies that correlated with stability, therefore improving the therapeutic ability of this antibody. Finally, a change in the expression system of the scFv-h3D6 was performed. The novel protein obtained in the eukaryotic system Pichia Pastoris maintained the same thermodynamic properties as the protein obtained from Escherichia coli. However, other properties were improved: homogeneity of the sample, absence of scrambled conformations, endotoxin free sample, better protein yield, easy purification and extrapolation to a larger scale. Therapeutic effectiveness was also demonstrated in vitro and in vivo. On the other hand, Aβ-Immunotherapy has long been studied in the treatment AD, but not how other molecules involved in the disease can affect antibody performance. To completely understand the possible interactions and effects among Aβ, scFv-h3D6, apoE and apoJ, we performed a complete study from all different perspectives: biophysical, cellular and in vivo. Instead of full-length apolipoproteins, we combined scFv-h3D6 with apolipoproteins (apo) E and J mimetic peptides (MP) composed of essential structures within these apolipoproteins for binding to other molecules. Biophysical studies showed that apoE-MP precluded the formation of protective WL fibrils by the scFv-h3D6/Aβ complex, and partially interfered with the scFv-h3D6-induced reduction in Aβ-uptake by astrocytes; whereas apoJ-MP allowed the formation of WL fibrils and did not interfere with the reduction in Aβ uptake. When looking at the inflammation associated with AD, apoE-MP developed an anti-inflammatory role in cell culture and in the 3xTg-AD mouse model; while apoJ-MP showed an anti-inflammatory profile only when combined with scFv-h3D6. ScFv-h3D6 alone did not induce microglial activation, contrary as previously shown with complete antibodies, but rather reduced it. Apolipoprotein E and J levels were reduced by scFv-h3D6, but increased by apoE-MP and apoJ-MP, affecting each other.

As a general conclusion, scFv-h3D6 treatment decreases Aβ burden, decreases astrocytic Aβ uptake, restores endogenous apoE and apoJ levels and ameliorates inflammation. Although, combined therapy with MPs should be further analyzed, this work demonstrates that all the effects of scFv-h3D6 are addressed to preclude AD pathology, without eliciting the detrimental effects shown by bapineuzumab in clinical trials.