Uso de líneas celulares como modelos in vitro para la evaluación de toxicidad y mecanismos de acción de contaminantes ambientales

Abstract

En esta tesis se investiga la utilidad de diferentes bioensayos basados en el uso de líneas celulares (peces/humanas) y fracciones subcelulares, para la caracterización del riesgo ambiental que diversos contaminantes orgánicos comportan tanto para los ecosistemas acuáticos como para la salud humana, con especial énfasis en disruptores endocrinos y ligandos de receptores celulares implicados en la biotransformación de xenobióticos. Por un lado, en este trabajo se caracteriza la calidad ambiental de sedimentos marinos costeros de diferentes áreas del Mar Mediterráneo, Mar Negro, estuario del Algarve, Bahía de Paraguaná (Brasil) y Mar de Weddell (Antártida), mediante una batería de bioensayos in vitro, basada en el uso combinado de la línea celular PLHC-1 (para determinar citotoxicidad, generación de estrés oxidativo e inducción CYP1A), células COS-7 transfectadas con el receptor zfPxr (detección de agonistas de zfPxr), y fracciones microsomales de ovario de lubina (Dicentrarchus labrax) (detección de agentes disruptores endocrinos capaces de inhibir la actividad del enzima P450 aromatasa). Los resultados obtenidos han permitido clasificar las áreas marinas según su nivel de presión antropogénica. Entre las áreas marinas estudiadas, destacan los puertos, las desembocaduras de grandes ríos (Danubio y Po), y la Bahía de Kaštela, como las más impactadas. Destacar así mismo la presencia de agonistas de AhR en los sedimentos de zonas remotas situadas en la Antártida, que se creían relativamente limpias de contaminantes antropogénicos. Por otro lado, se investiga la toxicidad de diferentes contaminantes emergentes, incluyendo ftalatos, bisfenol A, alquilfenoles y compuestos perfluorados, evaluando su capacidad de actuar como disruptores endocrinos y de alterar la composición lipídica en las células de placenta humana JEG-3, prestando especial atención a la biodisponibilidad de los compuestos en el medio de cultivo. Entre los contaminantes investigados, los alquilfenoles mostraban mayor citotoxicidad y potencial de disrupción endocrina, particularmente 4-dodecilfenol (DP), seguido de 4-nonilfenol (NP), 4-ter-octilfenol (OP), 4-heptilfenol (HP) y 2,4,6-tri-ter-butilfenol (TTBP). La toxicidad de los alquilfenoles estaba asociada a su hidrofobicidad, de manera que los compuestos con un coeficiente log Kow mayor, eran los más tóxicos. La capacidad de los alquilfenoles de cadena larga DP, OP y NP, de inducir la actividad P450 aromatasa en un rango de concentraciones tan reducido (10-30 µM) y tan cercano a su citotoxicidad, evidencia la necesidad de diseñar los ensayos de exposición con factores de dilución de la muestra lo suficientemente bajos, para facilitar la detección de estas respuestas. Los compuestos perfluorados PFOS, PFOA y PFBS, inhibían la actividad P450 aromatasa, con IC50 en el rango de 57 a 80 µM. Esto es de particular relevancia dado que, debido a su menor toxicidad, perfluorobutanosulfonato (PFBS) se está utilizando como sustituto de ácido perfluorooctanosulfonato (PFOS) y ácido perfluorooctanoico (PFOA). Los contaminantes NP, OP y dibutil ftalato (DBP) modulaban la actividad P450 aromatasa en células de placenta a concentraciones ambientalmente relevantes (5-40 µM), detectadas en cordón umbilical de bebés nacidos con problemas de poco peso. La aparente insensibilidad de las células JEG-3 a la exposición a ftalatos estaba asociada a su elevada hidrofobicidad y baja solubilidad en el medio de cultivo. Esto hace necesario determinar las concentraciones experimentales frente a las dosis teóricas en el medio de cultivo, para así no subestimar la toxicidad de estos compuestos. Los análisis químicos han permitido la detección de alteraciones en el perfil lipídico de células de placenta humana tras exposición a alquilfenoles. La exposición a DP y TTBP a concentraciones de 10 y 20 µM, respectivamente, inducían la acumulación de triacilglicéridos en dichas células, mientras que 20 µM de HP reducía significativamente las especies lipídicas más poliinsaturadas, las más susceptibles a oxidación. Dicho efecto, junto con la elevada respuesta observada en el ensayo de estrés oxidativo, sugieren que HP promueve la peroxidación lipídica en las células de placenta.

This thesis investigates the usefulness of different bioassays based on the use of cell lines (fish/human) and subcellular fractions, to characterize the environmental risk of various organic contaminants to both aquatic ecosystems and human health, with special emphasis on endocrine disruptors and ligands of cellular receptors involved in the biotransformation of xenobiotics.

On the one hand, the environmental quality of marine sediments of different areas of the Mediterranean Sea, the Black Sea, the Algarve estuary, the Bay of Paraguaná (Brazil) and the Weddell Sea (Antarctica) is characterized by in vitro bioassays in the PLHC-1 cell line (cytotoxicity, generation of oxidative stress and CYP1A induction), COS-7 cells transfected with the zfPxr receptor, and ovarian microsomal fractions of sea bass (Dicentrarchus labrax) (endocrine disruption). The marine areas were classified according to their level of anthropogenic pressure. The study highlights the presence of AhR agonists in the sediments of Antarctica.

On the other hand, the toxicity of several phthalates, bisphenol A, alkylphenols and perfluorinated compounds, is investigated, particularly their capacity to disrupt P450 aromatase activity and the lipid composition in JEG-3 human placental cells, with special attention to the bioavailability of the compounds in the culture medium. Alkylphenols showed the highest cytotoxicity and endocrine disruption potential. The perfluorinated compounds, perfluorooctane sulfonate (PFOS), perfluorooctanoic acid (PFOA) and perfluorobutanesulfonate (PFBS) inhibited P450 aromatase activity, which is of particular relevance since PFBS is being used as a substitute for PFOS and PFOA. NP, OP and dibutyl phthalate (DBP) modulated P450 aromatase activity at concentrations detected in the umbilical cord of babies born with low weight problems. The apparent insensitivity of JEG-3 cells to phthalates was associated with their low solubility in the culture medium, which makes it necessary to determine the experimental concentrations in order to not to underestimate the toxicity of these compounds. Exposure to DP and TTBP induced the accumulation of triacylglycerides, whereas HP reduced the amount of polyunsaturated lipids. This effect, together with the high response observed in the oxidative stress test, suggests that HP promotes lipid peroxidation in placental cells.