Coordinated effects of synaptic activity and muscle contraction on cpkc regulation by pdk1 and bdnf/trkb signalling. An approach towards the amyotrophic lateral sclerosis pathophysiology

Abstract

El sistema neuromuscular és un complex circuit interconnectat en el qual les motoneurones presinàptiques i cèl·lules de Schwann indiquen al múscul esquelètic com créixer, diferenciar-se i funcionar. D’altra banda, el múscul proporciona senyals, incloent les neurotrofines, que regulen la supervivència i les funcions de les motoneurones. En concret, la neurotrofina BDNF regulada per activitat, a l’unir-se al TrkB, pot activar diferents vies incloent les PKCs. Per tant, és important conèixer com opera l’activitat pre- i post-sinàptica en condicions fisiològiques per controlar la funció neuromuscular a través de la regulació del BDNF i PKCs. Per estudiar això, es va estimular el nervi frènic del diafragma de rata amb o sense contracció, per tal de separar els efectes de l’activitat sinàptica i la contracció muscular. A continuació es van realitzar les tècniques ELISA, Western Blot, qRT-PCR, immunofluorescència i electrofisiologia. Els resultats van mostrar que tant l’activitat sinàptica com la contracció muscular regulen la maduració i l’activació de la cPKCβI d’una manera complexa i equilibrada a través de la PDK1 y del BDNF/TrkB. Això determinarà la funcionalitat de la sinapsi ja que els resultats també van mostrar que la cPKCβI potencia l’alliberament d’acetilcolina. No obstant, què ocorre en l’esclerosi lateral amiotròfica (ELA) on l’activitat neuromuscular disminueix? Podria l’exercici físic, incrementant l’activitat neuromuscular, prevenir els símptomes? Per abordar això, es van realitzar protocols d’entrenament basats en la natació i el running i es va analitzar la via del BDNF en el múscul plantaris de ratolins SOD1-G93A mitjançant Western Blot. Els resultats van mostrar que en l’ELA, la senyalització del BDNF està alterada però es pot prevenir aquesta afectació de manera diferent en funció de la natura i/o intensitat de l’exercici físic imposat. En conjunt, aquí es mostra un plantejament mecanicista del rol coordinat entre els components pre- i post-sinàptics per preservar la funció sinàptica.

El sistema neuromuscular es un complejo circuito interconectado en el cual las motoneuronas presinápticas y células de Schwann indican al músculo esquelético cómo crecer, diferenciarse y funcionar. Por otra parte, el músculo proporciona señales, incluyendo las neurotrofinas, que regulan la supervivencia y las funciones de las motoneuronas. Concretamente, la neurotrofina BDNF regulada por actividad, al unirse a TrkB, puede activar diferentes vías incluyendo las PKCs. Por consiguiente, es importante conocer cómo opera la actividad pre- y post-sináptica en condiciones fisiológicas para controlar la función neuromuscular a través de la regulación de BDNF y PKCs. Para realizarlo, se estimuló el nervio frénico del diafragma de rata bloqueando o no la contracción, para separar los efectos de la actividad sináptica y de la contracción muscular. A continuación, se realizaron las técnicas ELISA, Western Blot, qRT-PCR, inmunofluorescencia y electrofisiología. Los resultados mostraron que tanto la actividad sináptica como la contracción muscular regulan la maduración y la activación de la cPKCβI de una manera compleja y balanceada a través de PDK1 y BDNF/TrkB. Esto determinará la funcionalidad de la sinapsis porque los resultados también mostraron que cPKCβI potencia la liberación de acetilcolina. Sin embargo, ¿qué ocurre en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) donde la actividad neuromuscular disminuye? ¿Podría el ejercicio físico, incrementando la actividad neuromuscular, prevenir los síntomas? Para abordar esto, se realizaron protocolos de entrenamiento basados en la natación y el running y se analizó la señalización del BDNF en el músculo plantaris de ratones SOD1-G93A mediante Western Blot. Los resultados mostraron que en ELA, la señalización del BDNF está alterada, pero se puede preservar este deterioro de diferente manera en función de la naturaleza y/o intensidad el ejercicio físico impuesto. En conjunto, aquí se muestra un planteamiento mecanicista del rol coordinado entre los componentes pre- y post-sinápticos para preservar la función sináptica.

The neuromuscular system is a complex and interconnected network in which presynaptic motoneurons and Schwann cells “tell” skeletal muscle to grow, to differentiate and how they should function. Conversely, skeletal muscle provides signals, including neurotrophins, that regulates the survival and function of motoneurons during development, maintenance and/or injury. Neurotrophins as BDNF, are regulated by activity and binding to TrkB triggers different pathways that impact on NMJ function, for example activating presynaptic PKCs. Thus, it is important to address how operates pre- and postsynaptic activities in physiological conditions to balance neuromuscular functionality through regulation of BDNF and PKC signalling. To address that, we stimulated the phrenic nerve of rat diaphragms with or without contraction to differentiate the effects of synaptic activity from that of muscle contraction. Then, we performed ELISA, Western Blot, qRT-PCR, immunofluorescence and electrophysiological techniques. Results showed that both synaptic activity and muscle contraction regulate cPKCβI maturation and activation in a complex and balanced way through PDK1 and BDNF/TrkB signalling. This regulation will determine NMJ functionality since our results also demonstrated that cPKCβI is directly involved in neurotransmission enhancing ACh release. However, what happens in a pathological context such us Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) where neuromuscular activity is decreased? Could therapies as physical exercise, increasing activity, prevent the symptoms of ALS? To address that, we performed running and swimming-based training protocols to analyse the BDNF signalling in the plantaris muscle of SOD1-G93A mice by Western Blot. Results showed that in ALS disease where there is a loss of the connection between nerve and muscle, BDNF signalling is impaired but could be prevented in a different way depending on the nature and the intensity of the physical exercise imposed. Altogether, these results provide a mechanistic insight into the coordinated role of pre- and postsynaptic components to accurately preserve NMJ function.