Campylobacter spp. en granjas de pollos de engorde: diversidad genética, resistencia antimicrobiana y factores de virulencia

Abstract

La campilobacteriosis es la zoonosis de transmisión alimentaria más comúnmente reportada en la Unión Europea (UE) desde 2005. La principal fuente de infección es el consumo o manipulación de carne de pollo contaminada con Campylobacter (principalmente C. jejuni y C. coli). La alta prevalencia de Campylobacter en pollos de engorde en granja supone un elevado riesgo de contaminación del producto final y por ende el riesgo de infección para el consumidor. Es por ello que para la UE es prioritaria la prevención y reducción del número de lotes positivos a Campylobacter en edad de sacrificio. De ahí la importancia de conocer en profundidad el comportamiento y la epidemiologia de este patógeno. De este modo, en el marco de esta tesis (i) se estudió la diversidad y dinámica de cepas de Campylobacter de pollos de engorde en granja; (ii) se caracterizaron los aislados desde el punto de vista de resistencia a un panel de antimicrobianos así como de genes de virulencia; (iii) se caracterizó en profundidad una selección de aislados mediante secuenciación masiva, analizando los mecanismos de resistencia, distribución de genes de virulencia, genotipo y relaciones filogenéticas. Los aislados objeto de estudio proceden de un estudio longitudinal previo, realizado durante dos años en cinco granjas de Cataluña. De aquellos lotes positivos a Campylobacter se conservaron una serie de aislados al azar de diferentes individuos a lo largo de cada crianza. Para estudiar en profundidad la diversidad, estacionalidad y dinámica de cepas de Campylobacter circulantes en las granjas, se realizó la tipificación molecular de los aislados utilizando las técnicas de electroforesis en campo pulsado (PFGE) y multilocus sequence typing (MLST). Mediante PFGE y utilizando dos enzimas de restricción, se analizaron un total de 343 aislados (254 de C. jejuni y 89 de C. coli) y se identificaron un total de 92 perfiles diferentes de macrorestricción (de 12 a 24 perfiles por granja). Globalmente, detectamos una gran diversidad genotípica, identificando mayoritariamente entre 1 y 2 genotipos diferentes por crianza, pero que no se aislaron en crianzas sucesivas. Por otro lado, observamos persistencia de algunos genotipos dentro de un mismo lote a lo largo de la crianza. Al comparar los aislados de las diferentes granjas, encontramos genotipos comunes de C. jejuni entre diferentes granjas. De los diferentes genotipos obtenidos mediante PFGE, seleccionamos un total de 127 aislados (93 de C. jejuni y 34 de C. coli) que analizamos mediante MLST, encontrando igualmente una gran diversidad genética. Los aislados de C. jejuni se agruparon en 15 complejos clonales (CC) distribuidos en 34 secuencias tipo (ST), mientras que los aislados de C. coli se agruparon en su totalidad dentro del CC828 distribuidos en 12 STs. Además, identificamos cinco STs nuevos de C. jejuni y dos de C. coli. Se observó cierta estacionalidad en determinados CC. Los CC21 y CC206 se encontraban a lo largo del año, excepto durante el trimestre más frío, siendo más frecuentes en los meses más cálidos. Por otro lado el CC48 se observó únicamente en los meses más cálidos. En el segundo estudio, evaluamos el perfil de susceptibilidad de 344 aislados frente a un panel de 12 antimicrobianos de diferentes familias, utilizando el método de difusión en disco. La resistencia a quinolonas (ácido nalidíxico y ciprofloxacina) fue la más prevalente, seguida de tetraciclinas. Esto representa un problema de salud pública importante puesto que éstos son los agentes más usados para tratar infecciones entéricas humanas. Por el contrario, las resistencias a eritromicina y gentamicina fueron las menos prevalentes. Todos los aislados analizados fueron sensibles a cloranfenicol, amoxicilina + clavulanato, imipenem y meropenem. Un 62,2% de los aislados fueron multiresistentes, siendo el perfil de resistencia más frecuente: ácido nalidixico, ciprofloxacina, enrofloxacina, tetraciclina, doxiciclina y ampicilina. Por otro lado, analizamos 14 genes de virulencia involucrados en la colonización e infección, donde observamos una distribución heterogénea de los mismos, en los aislados analizados. Cabe destacar la detección del gen wlaN en un 19% de aislados; este gen está relacionado con el síndrome de Guillain-Barré, un síndrome neurológico grave que puede desarrollarse tras una infección por Campylobacter. En el último estudio se realizó la secuenciación del genoma completo, mediante la plataforma Illumina, de un total de 16 aislados de C. jejuni y C. coli para su caracterización en profundidad. La tecnología de secuenciación masiva se ha convertido en una herramienta potente, rápida y asequible para caracterizar patógenos de interés como Campylobacter en estudios epidemiológicos. Los datos obtenidos en esta tesis confirman la diversidad genética de Campylobacter en los pollos de engorde y la gran complejidad de la dinámica de cepas circulantes en granja. Ello probablemente sea el principal factor que dificulta conseguir estrategias eficaces de control de la bacteria en granja. Por otro lado, la elevada proporción de cepas resistentes y multiresistentes a antibióticos, aisladas de pollos de engorde ponen de relieve la importancia de concienciar a los productores y/o encargados de la producción intensiva sobre el uso prudente de antimicrobianos. Unas medidas de bioseguridad efectivas para el control de Campylobacter en granja, no sólo conseguirían reducir la alta prevalencia de lotes positivos a edad de sacrificio, sino que indirectamente mejorarían el estatus sanitario general de la granja. Ello conllevaría una menor necesidad del uso terapéutico de antibióticos y probablemente una reducción de cepas resistentes.

Campylobacteriosis is the most commonly reported food-borne zoonosis in the European Union (EU) since 2005. The main source of infection is the consumption of chicken meat contaminated with Campylobacter (mainly C. jejuni and C. coli). The high prevalence of Campylobacter in broilers on farm represents a high risk of contamination of the final product and thereby the risk of infection for the consumer. Therefore, it is a priority for the EU to prevent and reduce the number of Campylobacter positive batches at slaughter age. For this, it is necessary to gain insight into the behaviour and epidemiology of this pathogen. Thus, within the framework of this PhD thesis we performed a number of studies: (i) we studied the diversity and dynamics of Campylobacter strains from broilers on farm; (ii) we characterized the isolates in terms of resistance against a panel of antimicrobials and the presence of virulence-associated genes; (iii) we characterized in depth a selection of isolates by whole genome sequencing, analysing the mechanisms for resistance, the distribution of virulence-associated genes, the genotypes and their phylogenetic relationship. The isolates of these studies came from a two-year longitudinal study, performed in five different farms from Catalonia. From the Campylobacter-positive crops, randomly selected isolates from different birds along the rearing cycles were preserved. In order to study in depth the diversity, seasonality and dynamics of Campylobacter strains circulating in farms, molecular typing of the isolates was performed using Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) and Multilocus Sequence Typing (MLST). By PFGE and using two restriction enzymes, a total of 343 isolates were analysed (C. jejuni n = 254 and C. coli n = 89) and overall 92 macrorestriction profiles (between 12 and 24 profiles per farm) were identified. Overall, a large genotypic diversity was detected, identifying mostly between 1 and 2 different genotypes per crop, although not isolated from successive crops. On the other hand, it was observed persistent genotypes within the same crop along the rearing cycle. When comparing the isolates from different farms, common C. jejuni genotypes among different farms were found. A total of 127 isolates were selected (93 C. jejuni and 34 C. coli) from the different PFGE genotypes, which were analysed by MLST, and high genetic diversity was observed as well. The C. jejuni isolates were grouped in 15 different clonal complexes (CC) distributed in 34 sequence types (ST), whereas the C. coli isolates were all grouped within the CC828, distributed in 12 STs. In addition, we identified five novel STs of C. jejuni and two of C. coli. Certain seasonality was observed for some CC. The CC21 and CC206 were found along the year, except during the coldest trimester, being more commonly found during the warmer months. In the second study, we evaluated the susceptibility of the 344 isolates against a panel of 12 antimicrobials of different families using the disc diffusion method. Resistance to quinolones (nalidixic acid and ciprofloxacin) was the most frequent, followed by tetracyclines. This represents a major public health problem, given that these are the drugs of choice for treating human enteric infections. In contrast, resistance against erythromycin and gentamycin were the less prevalent. All the analysed isolates were sensitive to chloramphenicol, amoxicillin + clavulanate, imipenem and meropenem. A 62,2% of all the isolates were multidrug resistant, being nalidixic acid, ciprofloxacin, enrofloxacin, tetracycline, doxicycline and ampicillin, the most frequent profile. On the other hand, 14 virulence genes involved in colonization and infection were analysed, and a heterogeneous distribution in the analysed isolates was observed. It is worth noting the detection of the wlaN gene in 19% of the isolates; this gene is involved in the Guillain-Barré syndrome, a serious neurological syndrome that may develop after Campylobacter infection. In the last study, whole genome sequencing using the Illumina platform was performed in 16 C. jejuni and C. coli isolates for their in-depth characterization. High throughput sequencing has become a powerful, fast and accessible tool for characterizing pathogens such as Campylobacter in epidemiological studies. Data obtained in this PhD thesis confirms the genetic diversity of Campylobacter in broilers and the great complexity of strain dynamics on farm. This may be the main factor that hampers effective control strategies of this bacterium on farm. Likewise, the high frequency of resistant and multiresistant strains isolated from broilers highlight the importance of making the producers an d/or managers of intensive poultry production aware about the prudent use of antimicrobials. Effective biosecurity measures to control Campylobacter in the farm, not only would reduce the high prevalence of positive batches at slaughter age, but indirectly would also improve the overall sanitary status of the farms. This would lower the need for the therapeutic use of antibiotics and would probably lead to a reduction in resistant strains.