Chloroperoxidase and D-fructose-6-phosphate aldolase in enzymatic cascade reactions for the synthesis of iminocyclitols

Abstract

Aquest treball de tesi se centra en la viabilitat d’una reacció en cascada formada per una peroxidasa i una aldolasa per a la síntesi d’iminociclitols, que són inhibidors de glicosidases amb un enorme potencial terapèutic en moltes malalties, alterant la glicosilació o el catabolisme de glicoproteïnes. El sistema proposat consisteix en dos enzims –cloroperoxidasa (CPO) i D-fructosa-6-fosfat aldolasa (FSA)– per a la formació del precursor de D-fagomina, seleccionat com l’iminociclitol d’interès per a avaluar la viabilitat de l’acoblament d’ambdues reaccions. El substrat inicial és un β-amino alcohol (N-Cbz-3-aminopropanol, β-OH), que és oxidat a N-Cbz-3-aminopropanal (β-CHO) per CPO, en presència del peròxid. FSA catalitza l’addició aldòlica de dihidroxiacetona a β-CHO per donar lloc al producte final. Ambdues reaccions són investigades per a entendre el mecanisme de reacció, preparar biocatalitzadors estables adequats i trobar les millors condicions per a la seva aplicació. S’analitza la capacitat oxidativa d’amino alcohols de CPO en funció de l’estructura del substrat. Seguidament, es realitzen proves experimentals de l’oxidació de β-OH per a determinar les principals condicions d’operació per als primers assaigs de la reacció acoblada. Tanmateix, s’observen la inactivació d’ambdós enzims i l’existència de reaccions no desitjades, com l’oxidació de β-CHO a N-Cbz-3-aminopropanoic acid (β-COOH) i la reacció química aldehid-peròxid. La modelització cinètica de totes les reaccions representa una aproximació a un millor enteniment del sistema i una possible estratègia d’optimitzar-lo. Es desenvolupa i es valida un model matemàtic de la reacció. Paral·lelament, la immobilització d’enzims representa una segona estratègia de millora del sistema, reduint la inactivació de CPO i FSA. S’estudia la immobilització d’ambdós enzims en suports convencionals d’agarosa funcionalitzats i en clústers de nanopartícules magnètiques. Finalment, el model cinètic és usat per a la intensificació del procés per tal de determinar les condicions òptimes per a l’acoblament de les reaccions. S’avaluen dues configuracions de reactor: un sol reactor (one-pot), i dos reactors en sèrie. Es comparen ambdues estratègies en funció de si s’utilitzen CPO/FSA solubles o immobilitzats.

This thesis work is focused on the feasibility of a peroxidase/aldolase cascade reaction for the synthesis of iminocyclitols, which are glycosidase inhibitors with enormous therapeutic potential in many diseases by altering the glycosylation or catabolism of glycoproteins. The proposed system consists of two enzymes –chloroperoxidase (CPO) and D-fructose-6-phosphate aldolase (FSA)– for the formation of the precursor of D-fagomine, selected as target iminocyclitol to evaluate the viability of the coupling of both reactions. The starting substrate is a β-amino alcohol (N-Cbz-3-aminopropanol, β-OH), which is oxidized to N-Cbz-3-aminopropanal (β-CHO) by CPO in presence of peroxide. FSA catalyzes the aldol addition of dihydroxyacetone to β-CHO to render the final product. Both reactions are investigated in order to understand the reaction mechanism, prepare suitable stabilized biocatalysts, and find the proper conditions for its application. The amino alcohol oxidative capacity of CPO regarding the substrate structure is discussed, followed by experimental trials on the β-OH oxidation to determine the main operating conditions for the first assays of the coupled reaction. However, the inactivation of both enzymes and the existence of side reactions, such as the further oxidation of β-CHO to N-Cbz-3-aminopropanoic acid (β-COOH) and a chemical reaction aldehyde-peroxide, are observed. Kinetic modeling of all the reactions represents an approach for a better understanding of the system and a possible strategy to optimize it. A mathematical model is systematically developed and validated. Concurrently, enzyme immobilization becomes a second strategy for the system improvement, by reducing the inactivation of CPO and FSA. The immobilization of both enzymes on functionalized conventional supports of agarose and magnetic nanoparticle clusters is studied. Finally, the kinetic model is employed for process intensification to determine the optimal conditions for the reaction coupling. Two reactor configurations are assayed: one-pot or two-consecutive vessels. Both strategies are compared using soluble and immobilized CPO/FSA.