Caracterización estructural y funcional de dos metalo-carboxipeptidasas de la familia M14 con especificidad de sustrato tipo acídico: carboxipeptidasa citosólica 6 y carboxipeptidasa O humanas

Abstract

Las metalo-carboxipeptidasas (MCPs) son exopeptidasas que contienen un átomo de zinc en el centro activo y que participan en la hidrólisis de enlaces peptídicos C-t de péptidos y proteínas. La carboxipeptidasa A1 (CPA1) fue la primera peptidasa M14 identificada y se aisló hace más de 80 años a partir de extractos de páncreas. Desde entonces, el número de MCPs pancreáticas y extra-pancreáticas pertenecientes a esta familia ha ido incrementándose considerablemente. En mamíferos, estas enzimas están relacionadas con un amplio rango de procesos biológicos, como la digestión de proteínas, la regulación de la fibrinólisis en la sangre, la maduración de neuropéptidos, o el procesamiento especifico de la tubulina, entre otras funciones. En esta tesis hemos llevado a cabo la caracterización bioquímica, funcional y/o estructural de dos MCPs de la familia M14 con una especificidad de sustrato tipo acídico: la carboxipeptidasa citosólica 6 (hCCP6) y la carboxipeptidasa O (hCPO) humanas. Estas MCPs han sido muy poco estudiadas debido a su descubrimiento reciente, y en parte, a la dificultad para su producción recombinante. Este hecho hace que exista un vacío de conocimiento acerca de los determinantes estructurales que definen la especificidad de sustrato por residuos acídicos C-t en las MCPs de la familia M14. Por ello, nuestro trabajo se ha centrado principalmente en el estudio de las características estructurales que determinan la preferencia de sustrato por residuos ácidos C-terminales en la hCCP6 y la hCPO, además de otros aspectos relacionados con su función específica e inhibición por inhibidores específicos. En el capítulo I presentamos la caracterización bioquímica y funcional de la hCCP6, una exopeptidasa intracelular que modifica post-traduccionalmente la tubulina que forma parte de los microtúbulos celulares, participando así en la regulación de su estabilidad y funcionalidad. Además de la tubulina, también es capaz de actuar sobre otros sustratos intracelulares como la quinasa de la cadena ligera de la miosina (MLCK1) y la teloquina. El trabajo realizado, contribuye notablemente al conocimiento acerca de la función y estructura de la hCCP6, a la vez que asienta las bases para establecer nuevas líneas de investigación que ayuden a comprender los mecanismos de regulación existentes in vivo para modular los niveles de poliglutamilación en la tubulina de los microtúbulos y la identificación de nuevos sustratos endógenos para la hCCP6. En el capítulo II mostramos la primera estructura tridimensional de la hCPO, una nueva MCP digestiva de la familia M14 que actúa complementando la acción digestiva de las MCPs pancreáticas mediante la hidrólisis de residuos ácidos C-t de proteínas y péptidos procedentes de la dieta. Gracias a este trabajo, hemos podido comprender mejor las características estructurales que determinan la preferencia de la hCPO por la hidrólisis de enlaces peptídicos C-terminales de residuos ácidos. Además, la obtención de la estructura de la hCPO en complejo con el inhibidor de carboxipeptidasas de Nerita versicolor (NvCI), nos ha permitido conocer en detalle el mecanismo de acción de este inhibidor de la hCPO. Finalmente, en este capítulo se presentan distintas aproximaciones bioquímicas que se han llevado a cabo para caracterizar la especificidad de sustrato de esta enzima e investigar su rol funcional en su localización intestinal en humanos.

Metallo-carboxypeptidases (MCPs) are exopeptidases, which contain a zinc atom in the active site, involved in the hydrolysis of peptide bonds at the C-terminus of peptides and proteins. Carboxypeptidase A1 (CPA1) was the first M14 peptidase identified. This enzyme was isolated more than 80 years ago from pancreatic extracts. Since then, the number of pancreatic and extra-pancreatic MCPs belonging to this family has been increasing. In mammals, these enzymes are related to a wide range of biological processes, such as protein digestion, regulation of fibrinolysis in the blood, maturation of neuropeptides, or specific processing of tubulin, among other functions. In this thesis, we have carried out the biochemical, functional and structural characterization of two M14 MCPs with an acidic substrate specificity: cytosolic carboxypeptidase 6 (hCCP6) and human carboxypeptidase O (hCPO). These MCPs have been poorly studied in the past due to their recent discovery, and due to the difficulty of their production using conventional expression systems. For these reasons, there is a lack of knowledge regarding the structural determinants that define the substrate specificity for C-t acidic residues in the M14 family MCPs. The main goal of our work was the study of the structural characteristics that determine the substrate preference for C-terminal acid residues in hCCP6 and hCPO, as well as the study of other aspects related to its particular function and inhibition. In chapter I we present the biochemical and functional characterization of hCCP6, an intracellular exopeptidase which participate in the post-translational modification of the C-t of tubulin. In particular, this enzyme is involved in the removal of C-t Glu residues in tubulin from the microtubules of the cell, thus participating in the regulation of its stability and functionality. In addition to tubulin, hCCP6 can cleave other intracellular substrates such the myosin light-chain kinase (MLCK1) and telokin. The current work is an important contribution with the aim to expand the current knowledge about the function and structure of hCCP6, to stablish the basis for future lines of research which will help us to understand the mechanisms of regulation of the polyglutamylation in tubulin, and to identify new endogenous substrates for hCCP6. In Chapter II we present for the first time the three-dimensional structure of hCPO in complex with the Nerita versicolor carboxypeptidase inhibitor (NvCI). hCPO is a novel digestive MCP of the M14 family which acts complementing the actions of pancreatic MCPs by hydrolyzing C-t acidic residues of dietary proteins and peptides. Thanks to this work, we have been able to increase the understanding of the structural features that determine the substrate preference for acidic residues in hCPO. Moreover, the analysis of the structure of hCPO in complex with NvCI revealed important molecular details about the mechanism of action of this inhibitor. Finally, in this chapter we applied a set of different biochemical approaches to characterize the substrate specificity of this enzyme, and to investigate the functional role of this protease in the intestinal tract in humans.