Further approaches on sperm cryopreservation protocol towards the establishment of the sperm bank from endangered native Catalan ram breeds (Xisqueta and Aranesa)

Abstract

En esta tesis doctoral, el objetivo principal fue proporcionar más información sobre los procesos de crioconservación de espermatozoides de Aranesa y Xisqueta así como explorara estrategias para loa mejora de su calidad tras la descongelación previo a su aplicación. Para ello, se evaluó el efecto estacional y la implantación de melatonina en sus características reproductivas. Además, la calidad del semen conservado a 50C durante 24h en un medio de congelación obtenido de diferentes machos fuera y dentro de la época reproductiva fue analizado. El objetivo fue proporcionar información útil sobre el efecto de la refrigeración en la calidad de los espermatozoides mantenidos durante cierto tiempo antes de su crioconservación o como alternativa al semen congelado para su uso en IA. Este estudio demostró que los implantes de melatonina en los machos fuera de la época reproductiva mejoraron casi todos los parámetros espermáticos estudiados durante su conservación mediante refrigeración. Asimismo, en esta tesis, la eficacia de 2 métodos de recogida de semen, electroeyaculación (EE) vs. Vagina Artificial (AV)) sobre la calidad del semen fresco y descongelado de Aranesa ha sido analizada, con el objetivo de conocer la posibilidad de crear de forma rápida un banco de semen, especialmente a partir de un elevado número de machos no entrenados, aportando información esencial acerca de estos métodos de recogida de semen sobre la calidad de los espermatozoides pre- y post-descongelación. Nuestros resultados demuestran la inclusión del método de EE como alternativa viable y más rápida para la recogida de semen dentro del desarrollo del programa de conservación y establecimiento de criobanco de semen de Aranesa. Otro estudio de la presente tesis evaluó la calidad seminal de los espermatozoides ovinos criopreservados con o sin plasma seminal bajo condiciones controladas y sujetos a un test de evaluación termal durante 4h tras la descongelación, siendo el objetivo de este test resistencia el proporcionar un mayor conocimiento sobre su capacidad de supervivencia en el tracto genital femenino y de fecundar al óvulo. Este estudio demostró que la presencia de plasma seminal plasma previa a la congelación fue beneficiosa para el mantenimiento de la motilidad espermática tras la descongelación y muy útil para la creación del banco de semen.

Por último, se evaluó también el efecto del lavado por centrifugación de los espermatozoides descongelados y la subsiguiente suplementación con plasma seminal (20%) recogido por EE fuera y dentro de la época reproductiva y por VA durante la estación reproductiva, seguido de un periodo de incubación de 90 min. El objetivo era conocer si la suplementación de las dosis seminales con plasma seminal de distinto origen tras un test de Resistencia térmica a 37oC podría mejorar la calidad y supervivencia de los espermatozoides descongelados durante su paso a lo largo del tracto genital femenino. Este estudio demostró que la adición de plasma seminal, independientemente de su origen, mantiene las funciones espermáticas y características de motilidad durante el periodo de incubación tras la descongelación. De la misma manera, se observó que el lavado por centrifugación o la eliminación del diluyente tras la descongelación no es necesario.

Podemos concluir que la aplicación de implantes de melatonina a los sementales durante la época no reproductiva proporcionó un efecto beneficioso en los espermatozoides de morueco durante la refrigeración, la inclusión de la electoeyaculación como método de recogida de semen de la raza Aranesa para el establecimiento de un banco de semen es recomendable, y finalmente, la presencia de plasma seminal previo a la criopreservación o su adición tras la descongelación de los espermatozoides es importante para el mantenimiento de la motilidad y demás funciones espermáticas.

The new interest towards the characterization and conservation of Aranesa and Xisqueta ram breeds was constituted by ex situ programs using techniques such as semen cryopreservation following its ultimate use for artificial insemination. However, there are still concerns due to issues regarding frozen-thawed sperm quality. Therefore, with the present technological advances made on sperm evaluating techniques, a wealth of information on their sperm characteristics may be achieved, improving the application of refrigerated and frozen-thawed semen technology. In this doctoral thesis, the general aim was to provide some more information on Aranesa and Xisqueta sperm processes for cryopreservation as well as exploring some strategies towards improving their post-thawed sperm quality prior to testing for further application. To this regard, we evaluated the seasonal effect and melatonin implantation on their reproductive characteristics. In addition, the quality of sperm stored at 50C for 24h in a cryopreservation media from the various ram donors during a non-breeding and breeding season was determined. The goal was to provide some useful information on the effect of chilled liquid storage on sperm quality held for a period of time prior to cryopreservation or as an alternative to frozen-thawed semen for AI. This study demonstrated that melatonin implantation to rams during the non-breeding season improved almost all sperm parameters studied during chilled liquid semen storage. Furthermore, in this thesis, the efficacy of two collection methods electroejaculation (EE) vs. artificial vagina (AV)) on fresh and post-thawed sperm quality of Aranesa ram sperm. The objective being that for rapid constitution of the sperm bank especially from a large number of untrained males within a short period of time, information on semen recovery methods on pre- and post-thawed sperm quality is essential. Our finding supports the inclusion of EE method as a viable alternative and quicker method for semen collection towards the ongoing conservation program and establishment of Aranesa sperm cryobank. Another study in this thesis evaluated the sperm motility and qualitative characteristics of ram spermatozoa cryopreserved with or without seminal plasma under a controlled condition and subjected to a 4 h post-thawing thermal evaluation test. The goal being that exposing these frozen-thawed sperm to thermal resistance test will provide some knowledge on their survivability in the female genital tract towards fertilizing the ovum. This study demonstrated that the presence of seminal plasma prior to cryopreservation was beneficial in maintaining post thawed sperm motility, and as such, may be useful for ex situ ram sperm cryopreservation towards its use for artificial insemination.

The last study in this thesis evaluated the effect of washing frozen-thawed sperm by centrifugation and subsequently supplementing with whole seminal plasma (20%) collected by EE from a non-breeding and breeding season or by AV from a breeding season, following a 90 min incubation period. The aim being that supplementing these sperm samples with different seminal plasma source following a thermal resistance test at 37oC will provide some insight as regards their quality and survivability in the female genital tract. This study demonstrates that supplementing frozen-thawed sperm with seminal plasma irrespective of its source maintained sperm functions and motility characteristics during a post-thawing incubation period. Furthermore, washing by centrifugation or removal of freezing component after thawing was not necessary.

We can therefore conclude that melatonin implants on male during a non-breeding season provided a beneficial effect on ram sperm during chilled liquid storage, the inclusion of EE as method for semen collection towards the establishment of a sperm bank is recommendable, and finally, the presence of seminal plasma prior to cryopreservation or its addition to post-thawed sperm was important in maintaining sperm motility and functions.