Structural and functional studies of AT-Rich DNA ligands and their effect on trypanosoma brucei

Abstract

AT-rich sequences confer unique properties to DNA, such as high polymorphism and flexibility. The abundance of AT-rich DNA in several pathogens' genomes and the ability of specific molecules to selectively target AT base pairs have prompted studies on ligands that interact with the minor groove of high AT content DNA. Of special interest are kinetoplastid parasites, such as Trypanosoma brucei, the causative agent of sleeping sickness, which are distinguished by the presence of a very AT-rich mitochondrial DNA structure called kinetoplast. Minor groove binding ligands have offered critical information on DNA molecular recognition, providing clinically useful strategies against diseases. Thus, the binding affinity and structural characteristics of AT-rich oligonucleotides in complex with different ligands, specifically with HMG proteins and bisimidazolinium compounds, has been chosen as the object of study. The `High Mobility Group¿ (HMG) is a family of architectural proteins that bind to DNA and influence a myriad of essential cellular processes. This research work has focused in two HMG subfamilies: HMGA and HMGB. They bind to the minor groove of the DNA by means of AT-hook (HMGA) or HMG-box (HMGB) domains. HMGA1a(50-91), HMGB1 box B and HMGB1 box AB have been expressed and purified. High similar binding affinity to an AT-rich DNA sequence containing [AATAAT_ATTATT] has been found by SPR¿biosensor experiments for both proteins. A d[CCAATAATCGCGATTATTGG]2-HMGB1 box B complex was crystallized. The diffraction patterns of the crystal at 2.68 Å resolution presented well-defined spots revealing two diffraction orientations. A series of derivatives of FR60 [4-((4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl)amino)-N-(4-((4,5-dihydro-1Himidazol-2-yl)amino)phenyl)benzamide] have been proved to be high affinity DNA binders with a preference for AT over GC-rich DNA, showing slight selectivity towards sequences containing [AATT] versus [(AT)4] or [AATAAT_ATTATT]. Furthermore, competition assays have demonstrated that JNI18 competes with HMGA1a and HMGB1 for binding to DNA and it is able to displace the proteins from their DNA binding sites. This last interaction is of prime importance, as related proteins have been found to be essential in kinetoplastid parasites. The structure of the bis(2-aminoimidazoline) compound CDIV32 with the oligonucleotide d[AAATTT]2 partially solved at 3.10 Å resolution, displays DNA columns of stacked oligonucleotides forming apseudo-continuous helix packed in a crossed column configuration of DNA helices that are at ~90° to each other. The presence of the drug CDIV32 modulates the organization of duplexes. The crystal structure of the complex of the oligonucleotide d[AAATTT]2 with the lead compound FR60, solved at atomic resolution of 1.25 Å (PDB-ID: 5LIT) by X-ray crystallography, is constituted of stacked oligonucleotides organized as infinite continuous parallel columns, packed in a pseudo-tetragonal configuration. The structure revealed that the drug interacts with the central [AATT] region, covers the minor groove of DNA, displaces bound water and interacts with neighboring DNA molecules as a crosslinking agent. Finally, a functional analysis has been performed on the effect of different bis(2-aminoimidazolines) on T.brucei (>70% AT kDNA) to assess whether parasite DNA was a target for these compounds. By a combination of flow cytometry and imaging techniques such as fluorescence microscopy and TEM, it was demonstrated that these compounds have a clear effect on the S-phase of T. brucei cell cycle by inflicting specific damage on the kinetoplast. It can be concluded that the studied DNA binding compounds FR60 and JNI18 are powerful trypanocides that act directly on the kinetoplast DNA. As the compounds show 100% curative activity in a mouse model of T. b. rhodesiense infection, they are potentially an effective chemotherapeutic agent for the treatment of sleeping sickness.

Las secuencias ricas en AT le confieren al ADN propiedades únicas como un alto polimorfismo y flexibilidad. Su abundancia en el genoma de varios patógenos y la selectividad de unión a secuencias AT que presentan ciertas moléculas, han llevado al estudio de ligandos que interactúan con el surco estrecho de DNA con alto contenido en AT. De especial interés son los parásitos kinetoplástidos, como el Trypanosoma brucei, agente causante de la enfermedad del sueño, los cuales se distinguen por la presencia de una estructura de ADN mitocondrial muy rica en AT llamada kinetoplasto. Los ligandos de unión al surco estrecho han ofrecido información primordial sobre el reconocimiento molecular del ADN, proporcionando estrategias terapéuticas útiles. Por ello, se ha elegido como objeto de estudio complejos de ADN ricos en AT con diferentes ligandos, específicamente con proteínas HMG y compuestos bisimidazolinio. Las HMG son una familia de proteínas arquitectónicas que se unen al ADN e influyen en numerosos procesos celulares esenciales. En este trabajo se han estudiado dos subfamilias de las HMG: HMGA y HMGB. Ambas se unen al surco estrecho del ADN mediante diferentes motivos de unión: AT-hook (HMGA) y HMG-box (HMGB). Se han expresado y purificado las formas HMGA1a(50-91), HMGB1 box B y HMGB1 box AB. Mediante SPR, ambas proteínas presentaron una afinidad de unión alta y similar hacia un ADN conteniendo la secuencia [AATAAT_ATTATT]. Se cristalizó el complejo d[CCAATAATCGCGATTATTGG]2- HMGB1 box B. La difracción a una resolución de 2.68 Å presentó reflexiones bien definidas que indicaban dos orientaciones preferenciales. Una serie de derivados del compuesto FR60 [4-((4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il)amino)-N-(4-((4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il)amino)fenil)benzamida] han demostrado ser ligandos de alta afinidad por secuencias AT con respecto a GC, mostrando cierta preferencia hacia secuencias con [AATT] comparado con [(AT)4] o [AATAAT_ATTATT]. Además, se ha demostrado que el JNI18 compite con la HMGA1a y la HMGB1 en su unión al ADN y es capaz de desplazar a dichas proteínas de sus sitios de unión al ADN. Este hecho es de especial relevancia, ya que se han encontrado proteínas relacionadas que son esenciales en parásitos kinetoplástidos. La estructura del compuesto de bis(2-aminoimidazolinio) CDIV32 con el oligonucleótido d[AAATTT]2 ha sido parcialmente resuelta a una resolución de 3.10 Å. Se encontraron columnas de oligonucleótidos apilados formando una hélice pseudo-continua, empaquetada en una configuración de columnas cruzadas perpendicularmente. La presencia del fármaco CDIV32 modula la organización de las hélices de ADN. Se ha resuelto la estructura cristalográfica del complejo d[AAATTT]2-FR60 a resolución atómica de 1.25 Å (PDB-ID: 5LIT). Se encontraron los oligonucleótidos apilados organizados en columnas infinitas y paralelas en una configuración pseudo-tetragonal. El fármaco interacciona con la región central [AATT], ocupa el surco estrecho del ADN, desplaza las moléculas de agua presentes e interactúa con moléculas de ADN vecinas como un agente entrecruzador. Finalmente, se ha realizado un análisis funcional del efecto de diferentes compuestos bis(2-aminoimidazolinio) en T. brucei (con >70% de AT en su kDNA) para evaluar si el ADN del parásito es una diana para estos compuestos. Se ha estudiado su efecto in vitro mediante una combinación decitometría de flujo y técnicas como microscopía de fluorescencia y TEM. Los resultados permitieron demostrar que estos compuestos tienen un efecto claro sobre la fase S del ciclo celular de T. brucei al dañar específicamente el kinetoplasto. Se ha podido concluir que los compuestos FR60 y JNI18 son potentes tripanocidas que actúan directamente sobre el ADN del kinetoplasto. Ya que los compuestos muestran una actividad curativa del 100% en un modelo de ratón infectado por T. b. rhodesiense, representan un agente quimioterapéutico potencialmente eficaz para el tratamiento de la enfermedad del sueño.