New insights into alzheimer’s disease: further characterization of the 3xTg-AD mouse model and a pharmacological approach with scFv-h3D6

Abstract

La malaltia d’Alzheimer és el desordre neurodegeneratiu més comú arreu del món. L’acumulació del pèptid beta-amiloide (Aβ) és el principal factor en el seu patomecanisme. El model murí 3xTg-AD ha esdevingut un dels models més populars d’aquesta malaltia perquè manifesta la patologia Aβ i tau seguint un patró regional i temporal similar als humans. Per una banda, aquesta tesi consisteix en la caracterització del model 3xTg-AD a 5 mesos d’edat, mitjançant tècniques bioquímiques, histològiques i conductuals. S’ha observat que, en aquesta edat, les neurones glutamatèrgiques són les que es troben afectades per la patologia Aβ. A més, el nivell d’aquesta afectació correlaciona amb la pèrdua neuronal en les diferents poblacions cel·lulars analitzades, donant suport a la neurodegeneració causadaa pel pèptid Aβ. A nivell perifèric, s’ha detectat esteatosis, que podria relacionar-se amb les alteracions en el metabolisme lipídic, i un engrandiment de la polpa vermella de la melsa, que donaria suport a la neteja d’Aβ a través dels eritròcits. També s’han observat símptomes amb tendències neuropsiquiatriques als 5 mesos d’edat. L’estudi longitudinal dels 5 als 9 mesos d’edat manifesta l’efecte compensatori de l’habituació i de l’estimulació cognitiva en el deteriorament conductual i cognitiu. D’altra banda, la principal estratègia actual de la recerca farmacològica contra la malaltia d’Alzheimer està dirigida als oligòmers d’Aβ, especialment per immunoteràpia. En aquesta tesi s’ha testat l’efecte d’una monodosi del fragment d’anticòs contra el pèptid Aβ derivat del bapineuzumab, scFv-h3D6, en ratolins 3xTg-AD joves. S’ha observat que el tractament prevé la mort neuronal i millora el deteriorament cognitiu i conductual, tot reduint el dipòsit de pèpetid Aβ. També s’ha observat que el tractament provoca que la polpa blanca de la melsa incrementi de mida, emfatitzant la possible contribució del sistema perifèric, a través dels macròfags, en l’eliminació del complex Aβ/scFv-h3D6. A més, els paràmetres farmacocinetics bàsics de l’scFv-h3D6 s’han determinat i comparat amb una variant elongada de la molècula, scFv-h3D6-EL. Tanmateix, la millor estabilitat termodinàmica, i la superior prevenció de la citotoxicitat de l’Aβ en cultius cel·lulars de neuroblastoma d’aquesta variant, no s’han traslladat a l’in vivo. També s’ha comprovat que l’scFv-h3D6, administrat intraperitonealment, es distribueix seguint un model compartimental i que creua la barrera hematoencefàlica. Un cop al cervell, és internalitzat per cèl·lules glials i per neurones, tant en forma d’scFv com formant el complexe Aβ/scFv-h3D6, depenent de la fase del procés. En conclusió, aquesta tesi proporciona noves perspectives en la malaltia d’Alzheimer, a partir de la caracterització del model 3xTg-AD i de l’aproximació farmacològica amb scFv-h3D6.

Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder worldwide. The accumulation of the amyloid-β peptide (Aβ) is considered a key factor in its pathomechanism. The 3xTg-AD mouse model has become one of the most popular models of AD since it is described to progressively develop Aβ and tau pathologies by following a regional- and temporal-pattern analogous to human. On the one hand, this thesis consists of the further understanding of AD by characterizing some treats of young (5-mo-old) 3xTg-AD mice by biochemical, histological, and behavioral assessing. Thus, in the central nervous system, we observed that glutamatergic neurons are the ones affected by the intracellular Aβ pathology at early stages of the disease. Interestingly, the extent of this pathology strongly correlated with neuron depletion, supporting the Aβ-mediated neurodegeneration. In the peripheral system, we detected hepatic steatosis, what could be related with alterations in the lipid metabolism, and enlarged red pulp from the spleen, supporting the erythrocyte-mediated clearance of Aβ. As well, behavioral and psychological-like symptoms and memory impairments were already exhibited at 5-mo-old. A longitudinal study from 5 to 9 months of age manifested the compensatory effect of the habituation and cognitive stimulation on the behavioral and cognitive deterioration. On the other hand, targeting Aβ oligomers, which is the most cytotoxic species, is currently the main strategy in AD pharmacological research, specially by immunotherapy. We tested the effect of a single dose of the anti-Aβ single-chain variable fragment derived from bapineuzumab, scFv-h3D6, in young 3xTg-AD mice. We found that the treatment prevented neuron depletion and improved cognitive impairment by reducing Aβ pathology in terms of both the percentage of neurons involved and intracellular burden. We also observed that the white pulp from the spleen significantly grown with the treatment, suggesting the peripheral contribution of the macrophage-mediated elimination of the Aβ/scFv-h3D6 complex. Furthermore, basic pharmacokinetic parameters of scFv-h3D6 were assessed and compared to an elongated version of the molecule, scFv-h3D6-EL. However, the improved thermodynamic stability and ability to rescue neuroblastoma cell-cultures from Aβ-induced toxicity displayed by scFv-h3D6-EL were not translated to mice. As well, intraperitoneal administered scFv-h3D6 was proven to be distributed as a compartmental model and, what is more interesting, to cross the blood-brain barrier. Once in the brain, it was internalized by both glial and neuron cells either as the isolated scFv or by forming Aβ/scFv-h3D6 complexes depending on the phase of the process. In conclusion, this thesis provides some new insights in AD by the further characterization of the 3xTg-AD mouse model and by the characterization of the pharmacological approach with scFv-h3D6.