Anàlisi comparativa de les propietats coordinants de MT2 i MT3 envers Zn, Cd i Cu respecte altres isoformes de MT de mamífer (MT1 i MT4)

Abstract

Les metal·lotioneïnes (MTs) són unes metal·loproteïnes de baix pes molecular i un elevat contingut en residus de cisteïna que els confereixen una gran capacitat per coordinar i intercanviar ions metàl·lics pesants. A més dels residus de cisteïna, existeixen altres lligands no proteics, com els lligands sulfur àcid-làbils, que també poden participar en la coordinació metàl·lica. L’estudi de les capacitats coordinants de les MTs ha permès classificar-les segons la seva preferència metàl·lica en Zn-tioneïnes i Cu-tioneïnes, així com demostrar l’existència d’una gradació entre aquests dos tipus extrems de MTs, donant lloc a un conjunt de proteïnes amb característiques intermèdies que podrien comportar-se com Cu-tioneïnes o Zn-tioneïnes depenent de les necessitats específiques de la cèl·lula. En els mamífers es troben 4 isoformes de metal·lotioneïna (MT1, MT2, MT3 i MT4). Aquestes 4 isoformes tenen 20 cisteïnes conservades en la seva seqüència proteica, i s’accepta que al unir-se a metalls divalents formen una estructura en dos dominis, β i α, que uneixen 3 i 4 ions divalents respectivament. MT1 i MT4 ja han estat estudiades per el nostre equip de recerca i han estat classificades com a Zn-tioneïna i Cu-tioneïna respectivament, així com els seus dominis. Amb l’objectiu d’ampliar el coneixement actual d’aquestes proteïnes, en aquesta Tesi Doctoral s’ha estudiat la capacitat coordinant respecte als metalls zinc, cadmi i coure de les dues isoformes restants de MT de mamífer, MT2 i MT3. Aquest estudi té com objectiu diferenciar la preferència metàl·lica de MT2, comparant-la amb MT1 (considerades fins ara equivalents), determinar les característiques de coordinació metàl·lica de MT3 i relacionar-les amb la seva funció biològica i, finalment, integrar les MTs de mamífer en la classificació global de les metal·lotioneïnes. Per això, s’han sintetitzat mitjançant enginyeria genètica aquestes isoformes i els seus dominis per separat a partir de cultius bacterians suplementats amb Zn, Cd o Cu. Els complexos metàl·lics així obtinguts s’han caracteritzat químicament mitjançant tècniques espectroscòpiques i espectromètriques (ESI-MS, ICP-AES, CD i UV-Vis). Els treballs realitzats amb la isoforma MT2 de mamífer i els seus dos dominis han permès conèixer les diferències de preferència metàl·lica respecta a MT1. Així, mentre que MT1 ha estat classificada com una Zn-tioneïna, MT2 presenta certes característiques de Cu-tioneïna, amb un domini β clarament Cu-tioneïna i un domini α Zn-tioneïna, que situa la isoforma en una pla intermedi en la classificació de les MTs. S’ha demostrat la relació entre les diferencies de seqüència entre les isoformes MT1 i MT2 i les seves preferències de coordinació metàl·lica, per la qual cosa es proposa que siguin considerades separadament, i no de manera conjunta com s’ha fet tradicionalment. Per altra banda, MT3 és clarament una Cu-tioneïna, amb els dos dominis Cu-tioneïna. De fer, s’ha revelat com una MT de caràcter Cu-tioneïna més accentuat que la mateixa MT4. Finalment, en aquesta Tesi Doctoral, s’ha pogut establir definitivament la gradació de preferència metàl·lica de totes les MTs de mamífer des de Zn-tioneïna a Cu-tioneïna tal i com segueix: MT1 > MT2 > MT4 > MT3, per posteriorment incloure aquestes isoformes en la classificació global de les MTs.

Las metalotioneínas (MTs) son unas metaloproteínas de bajo peso molecular y un elevado contenido en residuos de cisteína que les confieren gran capacidad de coordinar e intercambiar iones metálicos pesados. Además de los residuos de cisteína existen otros ligandos no proteicos, como los ligandos sulfuro ácido-lábiles, que también pueden participar en la coordinación metálica. El estudio de las capacidades coordinantes de las MTs ha permitido clasificarlas según su preferencia metálica en Zn-tioneínas y Cu-tioneínas así como demostrar la existencia de una gradación entre estos dos tipos extremos de MTs, dando lugar a un conjunto de proteínas con características intermedias que podrían comportarse como Cu-tioneínas o Zn-tioneínas dependiendo de las necesidades específicas de la célula. En mamífero se encuentran 4 isoformas de metalotioneína (MT1, MT2, MT3 y MT4). Estas 4 isoformas tienen 20 cisteínas conservadas en su secuencia proteica y, se acepta que al unirse a metales divalentes forman una estructura en dos dominios, β y α, que unen 3 y 4 iones divalentes respectivamente. MT1 y MT4 ya han sido estudiadas por nuestro equipo de investigación y clasificadas como Zn-tioneína y Cu-tioneína respectivamente, así como sus dominios. Con el objetivo de ampliar el conocimiento actual sobre estas proteínas, en esta Tesis Doctoral se ha estudiado la capacidad coordinante respecto a los metales zinc, cadmio y cobre de las dos isoformas restantes de MT de mamífero, MT2 y MT3. Este estudio tiene como objetivo diferenciar la preferencia metálica de MT2, comparándola con MT1 (consideradas hasta el momento como equivalentes), determinar las características de coordinación de MT3 y relacionarlas con su función biológica y, finalmente, integrar las MTs de mamífero en la clasificación global de las metalotioneínas. Para ello, se han sintetizado mediante ingeniería genética estas isoformas y sus dominios por separado a partir de cultivos bacterianos suplementados con Zn, Cd o Cu. Los complejos metálicos así obtenidos, se han caracterizado químicamente mediante técnicas espectroscópicas y espectrométricas (ESI-MS, ICP-AES, CD y UV-Vis). Los trabajos realizados con la isoforma MT2 de mamífero y sus dos dominios han permitido conocer las diferencias de preferencia metálica respecto a MT1. Así pues, mientras MT1 se había clasificado como Zn-tioneína, MT2 exhibe ciertas características de Cu-tioneína, con un dominio β claramente Cu-tioneína y un dominio α Zn-tioneína, que sitúan la isoforma en un plano intermedio en la clasificación de las MTs. Se ha demostrado la relación entre las diferencias de secuencia entre las isoformas MT1 y MT2 y sus preferencias de coordinación metálica, por lo que se propone la consideración separada de estas dos isoformas, y no conjunta como se ha hecho tradicionalmente. Por otra parte, MT3 es claramente una Cu-tioneína, con ambos dominios Cu-tioneína. De hecho se ha revelado como una MT de carácter Cu-tioneína más acentuado que la propia MT4. Finalmente, en esta Tesis Doctoral, se ha podido establecer definitivamente la gradación de preferencia metálica de todas las MTs de mamífero desde Zn-tioneína a Cu-tioneína como sigue: MT1 > MT2 > MT4 > MT3, para posteriormente incluir las isoformas en la clasificación global de las MTs.

Metallothioneins (MTs) are low molecular weight proteins with a high cysteine content, which confers them the ability to bind heavy metal ions. As well as the Cys residues, other kind of non-proteic ligands (such as acid labile sulfide) exist in MTs that also could participate in metal coordination. The study of the MT’s coordinative abilities has allowed classifying them following their metallic preferences as Zn- and Cu-thioneins, and to demonstrate the existence of a gradation between these two extreme MT’s types. These proteins with intermediate features could thus behave as Cu-thionein or Zn-thionein depending on the specific requirements of cell. In mammals, 4 isoforms of MT were found (MT1, MT2, MT3 and MT4). These 4 isoforms show 20 preserved Cys, and it’s accepted that in the union with divalent metals, they form a 2-domain structure (β and α) with 3 and 4 divalent ions, respectively. Our research team has already studied MT1 and MT4 and their domains, and classified them as Zn-thionein and Cu-thionein, respectively. With the objective of increasing the actual knowledge about these proteins, the Zn(II), Cd(II) and Cu(I) coordinative abilities of the 2 other mammal’s MT isoforms, MT2 and MT3 were studied. The goal of this PhD was to differentiate the metallic preferences of MT2 and MT1 (which were formerly considered as equal), to determinate the metallic coordinative characteristics of MT3 with respect to their biological function and finally, to integrate the mammal’s MT into the global MT classification. Using genetic engineering, these isoforms and their individual domains were synthetized from bacterial cultures in presence of Zn, Cd or Cu. The metal complex was chemically characterized using spectroscopy and spectrometry technics (ESI-MS, ICP-AES, CD i UV-Vis). These experiments showed different metallic preferences between MT2 and MT1. MT1 was identified as a Zn-thionein, whereas MT2 displays some characteristics of Cu-thioneins. The β domain of MT2 is a Cu-thionein and the α domain is a Zn-thionein, classifying MT2 as an intermediate MT into the global MT classification. The relationship between the sequence differences of MT1 and MT2, and their metallic coordinative preferences were demonstrated. These results suggest that MT1 and MT2 should be considered separately and not together as it was traditionally studied. On the other hand, MT3 is clearly a Cu-thionein, with 2 Cu-thionein domains, with a stronger Cu-thionein characteristic than MT4. Finally, this work has determined a gradation of metallic preferences of all mammal’s MTs, from Zn-thionein to Cu-thionein, as follow: MT1 > MT2 > MT4 > MT3. These isoforms were included into the global MT classification.