Papel de YFHI en la homeostasis del hierro y su relación con el estrés oxidativo en Saccharomyces cerevisiae

Abstract

El ferro és el metall de transició més important per als sistemes biològics. Al llarg de l'evolució, aquest metall s'ha convertit en un element essencial per a la cèl·lula. Això es deu al fet que posseeix una gran versatilitat com a catalitzador biològic, la qual cosa li ha permès formar part de processos biològics indispensables per a la vida. A més, se sap que l'adquisició d'aquest metall és un procés altament controlat. En cèl.lules eucariotes s'ha vist que la desregulació del metabolisme d'aquest metall està associada amb importants defectes que poden conduir, en última instància, a la pèrdua de la viabilitat cel·lular. En humans la sobrecàrrega de ferro s'ha associat a una varietat creixent de patologies, com per exemple, l’Ataxia de Friedreich. Aquesta malaltia és causada pel dèficit d'una proteïna anomenada frataxina. Nombrosos estudis relacionen a aquesta proteïna amb el metabolisme de ferro, ja que en diferents models s'ha vist que el seu dèficit provoca sobrecàrrega d'aquest metall i disminució de l'activitat dels enzims amb centres Fe-S. Aquesta disminució ha establert les bases per a què la majoria dels estudis la considerin essencial per a la biosíntesi d'aquests centres. No obstant això, la funció precisa d'aquesta proteïna es troba en discussió. Saccharomyces cerevisiae ha estat àmpliament utilitzat com a model d'estudi de la funció d'aquesta proteïna ja que posseeix un gen ortòleg anomenat YFH1 (Yeast frataxina homologue). Els resultats obtinguts en aquesta tesi, en què s'han analitzat mutants condicionals de YFH1, emfatitzen la implicació de Yfh1p en el metabolisme del ferro mitocondrial. L'activació del sistema d'alta afinitat d'adquisició de ferro és l'efecte primari de la depleció d'aquesta proteïna. Aquest fet constitueix una prova definitiva de la seva implicació en el metabolisme del ferro. No obstant això, l'anàlisi dels enzims amb centre Fe-S ha permès establir que aquesta activació no depèn del correcte funcionament d’aquest procés biosintètic mitocondrial, ja que la inactivació d'aquests enzims és posterior a l'activació del reguló de ferro. Per tant, la pèrdua d'activitat dels enzims Fe-S seria una conseqüència secundària d'un conjunt d'esdeveniments promoguts per la sobrecàrrega de ferro. Entre aquests esdeveniments destaca un increment del dany oxidatiu induït a les proteïnes (formació de carbonils), el qual seria el reflex d'un augment de l'estrès oxidatiu en l'interior de la mitocòndria. Aquest increment és el resultat de dos importants esdeveniments: i) l'augment del nivell de ferro a l’orgànul i ii) la pèrdua d'activitat de l'enzim antioxidant Mn-SOD. Es va trobar que aquesta pèrdua d'activitat era el resultat d'una baixa biodisponibilitat de manganès. A més es va observar que aquest baix contingut cel·lular de manganès era el resultat de la disminució de l’activitat del transportador Smf2p. Utilitzant el doble mutant yfh1aft1 es va aconseguir prevenir la disminució de l’activitat de l’esmentat transportador, la qual cosa va constituir la prova definitiva del rol de la sobrecàrrega de ferro en aquesta disminució. Es va trobar que la pèrdua de funció dels enzims dependents de centres Fe-S provoca una fallada en la capacitat respiratòria de la cèl·lula, la qual cosa condueix a una disminució del creixement. Una anàlisi de l'expressió gènica global (microarrays) va servir per a comprovar, una vegada més, l'activació de Aft1 i va demostrar que hi ha una resposta transcripcional del mutant davant la pèrdua de capacitat respiratòria. A més es va trobar que el factor de transcripció ADR1 podria tenir un paper clau en aquesta resposta. En resum, els resultats obtinguts permeten establir un jerarquia temporal entre els diferents esdeveniments que segueixen a la manca de YFH1.

El hierro es el metal de transición más importante para los sistemas biológicos. A lo largo de la evolución, este metal se ha convertido en un elemento esencial para la célula. Esto se debe a que posee una gran versatilidad como catalizador biológico, lo cual le ha permitido formar parte de procesos biológicos indispensables para la vida. Además, se sabe que la adquisición de este metal es un proceso altamente controlado. En células eucariotas se ha visto que la desregulación del metabolismo de este metal está asociada con importantes defectos que pueden conducir, en última instancia, a la pérdida de la viabilidad celular. En humanos la sobrecarga de hierro se ha asociado a una variedad cada vez mayor de patologías, como por ejemplo, la Ataxia de Friedreich. Dicha enfermedad es causada por el déficit de una proteína denominada frataxina. Numerosos estudios relacionan a esta proteína con el metabolismo de hierro, ya que en diferentes modelos se ha visto que su déficit provoca sobrecarga de este metal y disminución de la actividad de las enzimas con centros Fe-S. Esta disminución ha sentado las bases para que la mayoría de los estudios la consideren esencial para la biosíntesis de dichos centros. Sin embargo, la función precisa de esta proteína se encuentra en discusión. Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizado como modelo de estudio de la función de esta proteína ya que posee un gen ortólogo denominado YFH1 (Yeast frataxin homologue). Los resultados obtenidos en esta tesis, en la que se han empleado mutantes condicionales de YFH1, enfatizan la implicación de Yfh1p en el metabolismo del hierro mitocondrial. La activación del sistema de alta afinidad de adquisición de hierro es el efecto primario de la depleción de esta proteína. Este hecho, constituye una prueba definitiva de su implicación en el metabolismo del hierro. Sin embargo, el análisis de las enzimas con centro Fe-S ha permitido establecer que dicha activación no depende del correcto funcionamiento de este proceso biosintético mitocondrial, ya que la inactivación de estas enzimas ocurre posteriormente a la activación del regulón de hierro. Por ende, la pérdida de actividad de las enzimas Fe-S sería una consecuencia secundaria de un conjunto de eventos promovidos por la sobrecarga de hierro. Entre estos eventos destaca un incremento del daño oxidativo inducido a las proteínas (formación de carbonilos), el cual sería el reflejo de un aumento del estrés oxidativo en el interior de la mitocondria. Este incremento es el resultado de dos importantes eventos: i) el aumento del nivel de hierro en el organelo y ii) la pérdida de actividad de la enzima antioxidante Mn-SOD. Se encontró que esta pérdida de actividad era el resultado de una baja biodisponibilidad de manganeso. Además se observó que este bajo contenido celular de manganeso era el resultado de la down-regulación del transportador Smf2p. Utilizando el doble mutante yfh1aft1 se consiguió prevenir dicha down-regulación, lo cual constituyó la prueba definitiva del papel de la sobrecarga de hierro en dicha disminución. Se encontró que la pérdida de función de las enzimas Fe-S provocaba un fallo en la capacidad respiratoria de la célula, lo cual conduce a una disminución del crecimiento. Un análisis de la expresión génica global (microarrays) sirvió para comprobar, una vez más, la activación de AFT1 y demostró que existe una respuesta transcripcional del mutante frente a la pérdida de capacidad respiratoria. Además se encontró que el factor de transcripción ADR1 podría tener un papel clave en esta respuesta. En resumen, los resultados obtenidos permiten establecer un jerarquia temporal entre los distintos eventos que siguen a la falta de YFH1.

Iron is the most important transition metal for biological systems. This metal became an essential element for cell throughout the evolution. This fact is due to its versatility as a biological catalyst, which allowed it take part in essential biological processes. The uptake of this metal is a highly controlled process. In eukaryotic cells deregulation of the iron metabolism is associated with significant defects that can lead ultimately to the loss of cell viability. In humans iron overload has been associated with an increasing variety of diseases such as Friedreich's ataxia. This disease is caused by a deficiency in frataxin. Several studies link this protein to iron metabolism because its deficiency leads to iron overload. It has also described in different models that its deficit causes a decrease in the activity of Fe-S enzymes. Based on this observation, several authors consider frataxin essential for the biosynthesis of Fe-S centers. Nevertheless, the precise function of this protein remains unclear. Saccharomyces cerevisiae has been widely used as a model for studying the function of this protein. YFH1 (Yeast frataxin homologue) is the orthologue of this gene in yeast. The results obtained in this thesis using conditional YFH1 mutants emphasize the involvement of Yfh1p in mitochondrial iron metabolism. Activation of high affinity iron uptake system is a primary effect of Yfh1p depletion and constitutes a definitive probe of its implication in mitochondrial iron metabolism. Interestingly, the analysis of Fe-S enzymes established that the activation of the regulon it does not depend on the status of this mitochondrial biosynthetic pathway, since inactivation of this enzyme occurs long after the activation of the iron regulon. In fact, loss of Fe-S enzymes activity is a secondary consequence of a series of events promoted by iron overload. These events include an increase of oxidative damage to proteins (carbonylation), which would reflect an increase in oxidative stress conditions inside of mitochondria. This increase is the result of two major events: i) an increase in the level of iron in the organelle ii) the loss of the antioxidant enzyme Mn-SOD. It was found that this loss of activity was the result of low bioavailability of manganese. It was also observed that this low manganese content was due to the down-regulation of the Smf2p transporter. This down-regulation was prevented in yfh1aft1 double mutant. This was the definitive evidence that emphasized a key role for iron overload in this decrease. It was also found that decrease of Fe-S enzymes caused a failure in the respiratory capacity of the cell that lead to slow growth. A global gene expression analysis by microarrays further confirmed AFT1 activation and demonstrated that there is a yeast transcriptional response related to the loss of respiratory capacity. It was also found that the transcription factor ADR1 could play a central role in this response. In summary, the results obtained show a temporal order between the different events which follow the YFH1 deficiency. In summary, we have characterized in detail the biochemical events that are triggered by YHF1 depletion in order to identify the early events affected by the loss of this protein.