Histopathological, immunohistochemical and molecular characterization of ocular and adnexal involvement in canine leishmaniosis

Abstract

La leishmaniosis canina (LC) es una zoonosis endémica en el Mediterráneo, está causada por Leishmania infantum y se transmite por Phlebotomus. En áreas endémicas, la prevalencia de la infección es muy superior a la prevalencia de la enfermedad. La LC es una enfermedad sistémica y los perros se pueden presentar con gran variedad de signos clínicos. Los signos clínicos oculares aparecen en el 16% al 80% de los perros con leishmaniosis y queratoconjuntivitis seca (KCS) se diagnostica en 2 - 17% de ellos. Pocos estudios han investigado los mecanismos patogénicos que causan los signos clínicos oculares. El principal objetivo de este proyecto fue adquirir un mayor conocimiento de las alteraciones que ocurren en los ojos y anejos oculares de los perros con leishmaniosis. En el primer estudio se caracterizó el tipo de infiltrado inflamatorio presente en los ojos de perros con leishmaniosis, en qué estructuras oculares estaba localizado y se evaluó la presencia de amastigotes de Leishmania mediante inmunohistoquímica. El 30% de los globos oculares presentaban inflamación granulomatosa a piogranulomatoso con linfocitos y células plasmáticas. El parásito se detectó en el 26,6% de los ojos. El infiltrado granulomatoso y el parásito estaban asociados significativamente. Las estructuras afectadas fueron, por orden: conjuntiva y limbo, cuerpo ciliar, iris, córnea, esclera y ángulo iridocorneal, coroides y nervio óptico. El infiltrado inflamatorio y la detección del parásito estaban asociados significativamente con los signos clínicos oculares. Se evaluaron los músculos lisos y estriados intraoculares, extraoculares y de los anejos donde se observó infiltrado granulomatoso con parásitos de Leishmania. El infiltrado se detectó alrededor de las fibras musculares, en el endomisio. No se detectaron necrosis, degeneración o regeneración de las fibras musculares, aunque esporádicamente había atrofia de las fibras. Ocasionalmente, los parásitos estaban dentro de las fibras. La inflamación se detectó en al menos uno de los músculos examinados en 24,03% de los ojos y anejos evaluados. La implicación de estos músculos en la LC no se había descrito previamente, y puede contribuir a los signos clínicos descritos. Se procedió a la investigación de las glándulas encargadas de la síntesis del componente acuoso (glándula lacrimal principal (MLG) y glándula de la membrana nictitante (NMG)) y lipídico (glándulas de Meibomio (MG)) de la película lacrimal. Se encontró un infiltrado granulomatoso similar al descrito en los ojos, que rodeaba los conductos de dichas glándulas, y ocasionalmente rodeando los acinos. La MG y la NMG estaban más frecuentemente afectadas que la MLG. No hubo diferencias significativas en la detección de parásitos entre las distintas glándulas. Las muestras de ojos con signos clínicos compatibles con KCS mostraban el infiltrado granulomatoso y la presencia del parásito más frecuentemente que las muestras de ojos sin signos clínicos. Un posible mecanismo por el que los perros con leishmaniosis desarrollan KCS es la infiltración granulomatosa alrededor de los conductos de las glándulas lacrimales, lo que causaría retención de la secreción. Finalmente, se investigó la cantidad de parásitos en las MG, MLG y NMG mediante PCR cuantitativa. Parásitos de Leishmania se detectaron en todas las muestras analizadas en cantidades variables. En las tres glándulas, las muestras obtenidas de perros con signos clínicos tenían más parásitos que las muestras de perros sin signos clínicos. Se establecieron puntos de corte óptimos para las tres glándulas, de manera que las muestras con resultados por debajo del punto de corte tenían más probabilidad de pertenecer a perros con signos clínicos asociados a KCS que las muestras con resultados por encima del punto de corte. Establecer puntos de corte puede ayudar al clínico a determinar si los signos oculares se deben a leishmaniosis o a otras causas de KCS.

Canine leishmaniosis (CL) is an endemic zoonosis highly prevalent in the Mediterranean shore, where it is caused by Leishmania infantum and transmitted by Phlebotomus sand flies. In these areas, the prevalence of infection is much higher than the prevalence of disease. CL is a systemic disease and hence dogs can present with a wide variety of clinical signs. Ocular disease occurs in 16% to 80% of dogs with leishmaniosis and keratoconjunctivitis sicca (KCS) in 2% to 27% of dogs with leishmaniosis. Studies investigating the pathogenic mechanisms underlying ocular disease are sparse. The main objective of this project was to gain further knowledge about the events occurring in the eyes and adnexal structures from dogs affected by leishmaniosis. First, we characterized the inflammatory infiltrate present in the eyes, where this inflammation was located within the globe and evaluated the presence of Leishmania amastigotes by immunohistochemistry. Thirty percent of globes had some degree of granulomatous to pyogranulomatous infiltrate with variable lymphocytes and plasma cells. The parasite was detected in 26.6% of globes. There was a significant association between the granulomatous infiltrate and the parasite. Affected structures were, in order of involvement: conjunctiva and limbus, ciliary body, iris, cornea, sclera and iridocorneal angle, choroid and optic nerve sheath. Both the granulomatous infiltrate and the parasite were significantly associated with clinically diagnosed ocular disease. Intraocular, extraocular and adnexal smooth and striated muscles were evaluated, and granulomatous infiltrate with associated Leishmania parasites were noted. Inflammatory infiltrate was noted around muscle fibers, in the endomysium. Myofiber necrosis, degeneration or regeneration was not noted, although myofiber atrophy was rarely seen. Occasionally, parasites were noted within myofibers. Inflammation was noted in at least one of the muscles in 24.03% of the evaluated eyes and adnexa. Involvement of these muscles had not been previously reported in CL and may contribute to some of the reported clinical signs. Adnexal glands that synthesize the aqueous (main lacrimal gland (MLG) and nictitating membrane gland (NMG)) and lipid (Meibomian glands (MG)) components of the tear film were investigated next. A similar granulomatous infiltrate was noted surrounding the ducts and occasionally surrounding acini. MG and NMG were more commonly affected by theinfiltrate than MLG. No significant differences in detection of Leishmania parasites were noted between glands. Samples from eyes with clinical signs compatible with KCS were more commonly affected by the granulomatous infiltrate than those from eyes without clinical signs. A possible pathogenic mechanism of KCS in CL is that granulomatous infiltration around ducts of lacrimal glands, induced by the parasite, causes subsequent retention of secretion. Finally, the project focused on investigating the amount of parasites in MG, MLG and NMG by real-time PCR, in order to elucidate if the number of parasites was related to development of KCS associated to CL. Leishmania parasites were found in various amounts in all samples analyzed. For all three glands, samples from dogs with clinical signs contained significantly more parasites (lower ΔCt (Cycle threshold)) than samples from dogs without clinical signs. Optimal cut-off values of ΔCt were established for all three glands, so that samples with ΔCt below these cut-offs were more likely to be from dogs that displayed clinical signs related to KCS than samples with ΔCt above the cut-off. These findings indicate that cut-off values could aid the clinician in determining, in a dog infected with Leishmania spp., if compatible ocular clinical signs are due to leishmaniosis or to other causes of KCS.