PFKFB3: un gen clau en la reprogramació de les cèl·lules canceroses

Abstract

L’objectiu d’aquesta tesi doctoral és profunditzar en els mecanismes que fan de PFKFB3 un gen clau en la reprogramació metabòlica. En concret, s’estudia els mecanismes de connexió de la insulina i el TGF-β1 amb el metabolisme de la glucosa i PFKFB3 en les línies cel·lulars de carcinoma de colon (HT29) i glioblastoma multiforme (T98G), respectivament.

PFKFB3 és un enzim bifuncional homodimèric que pertany a la família de la 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6- bisfosfatasa (PFK-2/FBPasa-2), que controla la conversió entre la fructosa-6-fosfat (Fru-6-P) a fructosa-2,6-bisfosfat (Fru-2,6-P2). Aquest metabòlit és important per a la regulació del flux glicolític ja que és un potent activador al·lostèric de l’enzim limitant de la glicòlisi fosfofructoquinasa-1 (PFK-1). S’ha demostrat que PFKFB3 regula la glicòlisi durant la progressió del cicle cel·lular i el creixement. La seva activitat està regulada per HIF-1α, Akt, p38 i PTEN i es necessari per a la supervivència i creixement de molts tipus de càncer.

S’ha descrit que la insulina té un paper important en el creixement cel·lular i la supervivència del càncer. Als anys 70 es va descriure que concentracions fisiològiques d’insulina estimulen la proliferació de les cèl·lules de càncer de mama. També s’ha demostrat que l’expressió de TGF-β en gliomes malignes proporciona avantatges de supervivència de les cèl·lules tumorals potenciant el creixement cel·lular, la migració, la invasió, la angiogènesi, la immunosupressió i les propietats de les cèl·lules mare. A més, la presencia d’insulina i la sobrexpressió de TGF-β s’ha relacionat amb la inducció de l’efecte Warburg. En canvi, no es coneix amb detall els mecanismes moleculars que relacionen tant la insulina com el TGF-β amb una glicòlisi millorada en els sistemes tumorals i, especialment, amb la PFKFB3.

Tenint en conte això, la tesi es va organitzar en dos capítols de resultats. En el primer capítol, s’estudia la regulació de PFKFB3 en resposta a insulina en les cèl·lules HT29. Els resultats obtinguts demostren que la insulina provoca un augment significatiu de la concentració de Fru-2,6-P2 i de lacat intracel·lular ja als 30 minuts de tractament, que correlacionen amb l’activació de PFKFB3 i de PFKFB2 per fosforilació a través de la via de PI3K/Akt. En canvi, a temps més llargs, la insulina indueix l’expressió gènica de PFKFB3 i també participa la via de PI3K/Akt. La seqüència localitzada entre els nucleòtids -1269 i -1297 del promotor humà de PFKFB3 és la responsable d’aquesta inducció possiblement a través del factor SREB-1c. Al segon capítol, es presenta la regulació de diversos gens glicolítics, entre ells PFKFB3, en resposta a TGF-β1 en les cèl·lules de glioblastoma T98G. Els resultats obtinguts demostren que PFKFB3 és regulat a nivell transcripcional en resposta a aquest factor a través de l’activació conjunta de la via de Smad, p38 MAPK i PI3K/Akt. També es demostra que PFKFB3 és indispensable per al augment de la capacitat de les cèl·lules de formar colònies en resposta a TGF-β1.

En resum, els resultats presentats confirmen que PFKFB3 té un paper important en el metabolisme glicolític en les cèl·lules tumorals. Per tant, conèixer en profunditat els factors que dirigeixen l’expressió de PFKFB3 com els mecanismes moleculars que participen en la seva complexa regulació mitjançant diferents vies de transducció de senyals permet pensar en nous mètodes terapèutics basats en la seva inhibició, i així en la inhibició de l’elevada taxa glicolítica que suposa tenir-la activada.

PFKFB3 is a homodymeric bifunctional enzyme, belonging to the family of 6-phosphofructo-2- kinase/fructose-2,6-bisphosphatases, that controls the conversion of fructose-6-phosphate (Fru- 6-P) to fructose-2,6-bisphosphate (Fru-2,6-P2). This metabolite is important for the dynamic regulation of glycolytic flux by allosterically activating phosphofructokinase-1, a rate-limiting enzyme in glycolysis. Cancer cell lines produce markedly elevated levels of Fru-2,6-P2 when compared to non-malignant cells and it has been shown that PFKFB3 is highly expressed and regulated by HIF-1α, Akt, p38 and PTEN, and required for the survival and growth of multiple cancer types. In the present thesis we investigate the mechanism by which the expression of PFKFB3 gene is regulated by insulin and TGF-β1 in human colon adenocarcinoma (HT29) and glioblastoma (T98G) cell lines, respectively. Although insulin and TGF-β1 contribute to the metabolic reprogramming of cancer cells and tumor-associated stromal cells, little is known of the molecular mechanisms connecting these factors with enhanced glycolysis.

We demonstrate that the effect of insulin on Fru-2,6-P2 concentration correlates with changes in PFKFB3 phosphorylation state. Moreover, siRNA experiments confirm that PFKFB3 expression also contributes to the increase in Fru-2,6-P2 concentration induced by insulin. Then, we focus on the signalling cascades activated by insulin in HT29 cells using specific inhibitors of MAPK to analyze, at molecular level, the kinase pathway responsible of PFKFB3 regulation. We report here that insulin produce a significant induction of PFKFB3 mRNA in HT29 cell line and this induction is dependent on the PI3K/Akt pathway. Furthermore, our study reveals a 29nt sequence located at-1279 and -1288 in the PFKFB3 promoter that is implicated in the induction of PFKFB3 in response to insulin. Moreover, we demonstrate that TGF-β1 upregulates PFKFB3 mRNA and protein expression resulting in an increase in Fru-2,6-P2 concentration, glucose uptake, glycolytic flux and lactate production. Moreover, these increases in PFKFB3 mRNA and protein expression and Fru-2,6-P2 concentration were reduced when the Smad3, p38 mitogen- activated protein kinase (MAPK), and phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt signaling pathways were inhibited. We demonstrate that inhibition of PFKFB3 activity with 3PO or siRNA-mediated knockdown of PFKFB3 significantly eliminated the capacity of the T98G cells to form colonies by TGF-β1, one of the hallmarks of transformation.

Taken together, these results suggest a multimodal mechanism of insulin affecting PFKFB3 transcriptional regulation and kinase activation by protein phosphorylation, resulting in an increase in Fru-2,6-P2 concentration and stimulation of glycolysis in cancer cells.