Targeting the innate immune system to develop novel prophylactic strategies: lessons from amphioxus (B. lanceolatum) and zebrafish (D. rerio)

Abstract

La vacunació és una de les estratègies més efectives de control de les malalties infeccioses. Tot i així hi ha una clara falta de vacunes eficients o d’eines profilàctiques efectives per moltes especies de peixos d’interès comercial. Es necessiten més estudis de recerca bàsica i aplicada per millora la prevenciIBsTNFα) i els liposomes miniaturitzats NLc. Els IBsTNFα són altament estables, no toxics, i són un tipus de biomaterial proteic amb un baix cost de producció. Mitjançant intubació oral de peixos zebra adults i l’ús combinat de citometria, histologia i microscòpia confocal hem demostrat que els IBsTNFα poden atravessar l’epiteli de la mucosa intestinal, passar per la lamina propria i arribar a la capa muscular subjacent. A més l’expressió de gens relacionats amb la resposta innata està significativament regulada a l’alça en intestins de peix zebra. Finalment hem demostrat que els IBsTNFα poden protegir al peix zebra d’una infecció per Mycobacterium marinum. D’altra banda el sistema de nanoliposomes encapsulant LPS i Poly(I:C) o NLc, desenvolupats previament al laboratory, també protegeix al peix zebra contra una infecció letal de M. marinum. També hem explorat la viabilitat d’utilitzar M. marinum i A. hydrophila per desenvolupar un model d’infecció en larves de peix zebra. El model d’infecció de M. marinum no és viable ja que no podem induir mortalitats per inmersió; però el model amb A. hydrophila ha demostrat ser adequat ja que la mortalitat de les larves és depenent de la dosi infective d’A. hydrophila. Els NLc i els IBsTNFαadministrats per inmersió els localitzem a la faringe i l’intestí de les larves de peix zebra a dia 3 i 5 post fertilització. L’expressió de gens de resposta immune es veu regulada a l’alça després del tractament amb NLc. Encanvi no observem una expression a l’alça de gens inmunes després del tractament amb IBsTNFα i això correlaciona amb el fet que els IBsTNFα no protegeixen d’una infecció letal per A. hydrophila.

Immunization through vaccination is one of the most effective strategies to control infectious diseases. However, effective vaccines and alternative prophylactic tools for many fish diseases are still lacking. More studies on basic and applied immunology are required to improve the prevention and control of diseases in aquaculture. In this context, the thesis presents both basic and applied research. The Toll-like receptors (TLRs) are important for raising innate immune defense and their ligands are used as vaccine adjuvants to improve the immune responses. We studied the TLR system in the amphioxus B. lanceolatum. We identified 28 new putative TLR genes which consist in both non-vertebrate- and vertebrate-like TLRs. We cloned one of these genes, Bl_TLRj. The phylogenetic analysis together with functional analysis showed that it clusters with TLR11 family and particularly with subfamily 13. Moreover, Bl_TLRj responded against viral stimuli and showed high sequence identity with fish TLR13 and TLR22. Second, we developed two different infection models in zebrafish and we tested two potential nanoparticle adjuvants, IBsTNFα and NLc. The IBsTNFα are a highly stable, non-toxic, and low-cost protein-based biomaterial formed with nano-structured trout tumor necrosis factor alpha cytokine. Via oral intubation of adult zebrafish, combining flow cytometry, histology, and confocal microscopy, we show that IBsTNFα are able to cross the intestinal mucosal epithelial barriers, pass through the lamina propria, and reach the muscle layer. The expression of innate immune-related genes was significantly up-regulated in zebrafish intestine. Finally, IBsTNFα could protect zebrafish against a Mycobacterium marinum lethal infection when i.p. injected. The second particle tested, NLc, was previously developed in our lab and is composed by nanoliposomes encapsulating LPS and Poly I:C. The NLc was tested in our M. marinum bacterial infection model and it could protect zebrafish against a lethal infection when i.p. injected. Next, we explored the infective possibilities of two fish pathogens, M. marinum and Aeromonas hydrophila, in zebrafish larvae by immersion. The mortality of zebrafish larvae immersed with M. marinum showed no significant differences but zebrafish larvae infected with A. hydrophila by immersion showed significant differences compared to controls in a dose-dependent manner. NLc and IBsTNFα localized in the pharynx and intestine of zebrafish larvae at 3 and 5 dpf, respectively. The expression of immune-related genes such as IL-1β and IRF1α was significantly up-regulated after 48 h treatment with NLc in 2 dpf larvae. The 5 dpf larvae immersion in IBsTNFα could not significantly alter immune-related gene expression and IBsTNFα could not protect zebrafish larvae against A. hydrophila lethal infection.