Procés per a la síntesi enzimàtica total de l'octapèptid PhAc-CCK-8

Abstract

Aquesta tesi s'emmarca dins les investigacions realitzades en el Departament d'En-ginyeria Química de la Universitat Autònoma de Barcelona en col·laboració amb la Unitat de Química i Bioquímica de Proteïnes del CID-CSIC, en el camp de la síntesi enzimàtica de pèptids.<br/>El treball es centra en desenvolupar un procés per a la síntesi enzimàtica de l'octapèptid C-terminal de la CCK (CCK-8). L'interès més rellevant d'aquesta molècula és que presenta un ampli espectre d'activitat biològica i un elevat potencial terapèutic.<br/>- La introducció de la memòria s'ha distribuït en tres parts:<br/>- Diferents aspectes cabdals en la síntesi enzimàtica de pèptids.<br/>- Característiques i funcions de la CCK i CCK-8.<br/>- Un resum dels estudis previs realitzats sobre la síntesi enzimàtica del penta-pèp-tid C-terminal de la CCK-8, els quals han servit de punt de par-tida per aquest treball.<br/>- El capítol de resultats i discussió s'ha subdividit en diferents apartats.<br/>- Inicialment es presenten les investigacions de N-a protecció/desprotecció realitzades amb penicil·lina G acilasa (PGA) d'E. coli. Aquests estudis es van començar amb la N-a protecció de diferents derivats d'aminoàcids a escala analítica amb els grups protectors fenilacetil i mandelil (PhAc, Mand). Segui-da-ment aquestes reaccions es van realitzar a escala pre-pa-ra-tiva.<br/>En segon terme es presenta l'estudi de l'enllaç peptídic R-Gly-Trp-OBzl (dipèptid 4-5 de la CCK-8, on R: PhAc, Mand) amb l'objectiu d'investigar i comparar la influència dels grups protectors PhAc i Mand sobre la reactivitat del donador d'acil. Al mateix temps s'intenta optimitzar la reacció amb una finalitat de procés.<br/>Aquest estudi es tanca amb l'aplicació de la PGA en una reacció de despro-tecció del grup N-a protector. Concretament es tria desprotegir el grup PhAc del pentapèptid PhAc-Gly-Trp-Met-Asp(OBut)-Phe-NH2, etapa necessària per tal de poder abordar la síntesi de l'octapèptid.<br/>- En un segon bloc, s'inicia l'estudi de la síntesi del tripèptid N-terminal de la CCK-8 a escala analítica, a partir de les dues estratègies de síntesi possibles (Asp+Tyr)+Met i Asp+(Tyr+Met).<br/>- Seguidament es presenta un apartat dedicat a trobar unes bones condicions per a la síntesi de l'octapèptid i tot seguit s'introdueixen les modificacions necessàries per a l'obtenció de la PhAc-CCK-8.<br/>- L'últim bloc del capítol es destina a presentar el procés global per a la síntesi enzimàtica de la PhAc-CCK-8 a escala preparativa.<br/>Tenint com a base l'esquema de síntesi del pentapèptid dels estudis previs, es proposa un nou esquema amb la idea de definir un procés global per a la síntesi d'aquesta molècula. La viabilitat d'aquest esquema es comprova a escala analítica. Posteriorment es realitza la síntesi del pentapèptid i la desprotecció del grup PhAc, amb PGA, a escala de grams.<br/>A continuació es planteja el procés per a la síntesi del tripèptid N-terminal a partir de les condicions trobades anteriorment a escala analítica. <br/>Finalment es du a terme la síntesi de la PhAc-CCK-8 a escala preparativa.

This PhD dissertation is included in the research performed in the Chemical En-gi-neering Dept. of the UAB in collaboration with the Unitat de Química i Bio-quí-mica de Proteïnes of CSIC, in the field of enzymatic peptide synthesis.<br/>The main goal of this work is to develop a process for the enzymatic syn-thesis of the C-terminal octapeptide of CCK (CCK-8).The main interest of this molecule is its wide spectrum of biological activity and a great therapeutic po-tential.<br/>- The introductory chapter has consists of three parts:<br/>- Several capital aspects in the enzymatic peptide synthesis.<br/>- Features and functions of CCK and CCK-8.<br/>- An abstract of previous studies on the enzymatic synthesis of the C-terminal pen-ta-peptide of CCK-8. This work was the starting point of the present one.<br/>- The results and discussion chapter has been subdivided into several sections.<br/>- Firstable is showed the N-a protection/deprotection studies performed with pe-ni-cillin G acylase (PGA) from E. coli. These studies started with N-a pro-tec--tion of different aminoacid derivatives at anlytical scale using phenylacetil and mandelil (PhAc, Mand) as protecting groups. After that this reactions were carried out at preparative scale.<br/>Secondly the study of peptidic bond R-Gly-Trp-OBzl (dipeptide 4-5 of CCK-8 sequence, where R: PhAc, Mand) is shown, having in mind to compare the influence of PhAc and Mand protecting groups on the acyl donor reactivity. At the same time we optimize the reaction from a process approach.<br/>This study is closed applying PGA in a deprotection reaction of the N-a group. In particular it has been chosen the deprotection of the pentapeptide PhAc-Gly-Trp-Met-Asp(OBut)-Phe-NH2, because this stage is needed to achieve the octapeptide synthesis.<br/>- A second block covers the N-terminal tripeptide synthesis of CCK-8 at analytical scale, from the only two synthetic strategies (Asp+Tyr)+Met and Asp+(Tyr+Met).<br/>- The next block is devoted to find the best reaction conditions for the octapeptide synthesis and, afterwards, the introduction of the modifications required to obtain the PhAc-CCK-8.<br/>- The last block is focused on the global process for the enzymatic synthesis of PhAc-CCK-8 at preparative scale.<br/>Taking into account previous pentapeptide synthesis studies, a novel scheme is proposed to define a global process for the syn-thesis of this molecule. The feasibility of this scheme has been tested at analytical scale. Afterwards the pentapeptide synthesis and PhAc depro-tection (using PGA as a catalyst) have been performed at gram scale.<br/>Afterwards, the N-terminal tripeptide synthesis process is studied, taking into consideration the conditions at analytical scale previously stated. <br/>Finally the synthesis of PhAc-CCK-8 at preparative scale has been achieved.