Estudi d'estratègies de cultiu per a cèl·lules animals, basades en eines d'instrumentació i control

Abstract

En aquest treball s'ha abordat el problema de l'optimització dels cultius de cèl·lules animals, més específicament dels hibridomes, des de l'estudi de l'aplicació de diferents estratègies de cultiu, com les operacions en discontinu, discontinu alimentat, i continu amb perfusió. Aquestes estratègies de cultiu s'han realitzat en un bioreactor de tanc agitat amb l'ajut d'eines de monitoratge i control que genèricament s'han utilitzat per obtenir informació i poder actuar, en els casos que ha estat necessari, sobre l'entorn cel·lular. En l'estratègia en discontinu s'han validat les mesures de concentració cel·lular i d'activitat cel·lular, utilitzades per obtenir informació en línia de l'estat del cultiu, i s'ha optimitzat l'operació mitjançant la fortificació del medi de cultiu. Tot i que aquest és el sistema d'operació més estès des del punt de vista industrial, bàsicament per la seva simplicitat, es demostra que és clarament subòptim, ja que les cèl·lules es troben sotmeses sempre a un ambient canviant en què les condicions de cultiu són poc favorables. Mitjançant l'operació en discontinu alimentat s'ha intentat donar solució als problemes de l'operació en discontinu, tot canviant el metabolisme cel·lular fixant els substrats majoritaris a baixos nivells de concentració, i així poder reduir la producció de subproductes inhibitoris i, per tant, augmentar la concentració cel·lular i perllongar la vida del cultiu. Per a tal propòsit, s'ha fet necessari l'ús de diferents esquemes de control de nutrients amb l'ajut de les mesures implementades en línia i del disseny d'una solució concentrada d'addició. En concret, les estratègies desenvolupades graviten sobre dues mesures en línia, la de la concentració cel·lular i la del consum d'oxigen, indicativa de l'activitat cel·lular. De totes formes, encara que els subproductes es redueixen i la concentració cel·lular augmenta, no ho fa en prou quantia respecte al cultiu amb medi fortificat i, per tant, la productivitat augmenta molt lleument. Per eliminar els problemes tant de l'operació en discontinu com de l'operació en discontinu alimentat, les cèl·lules són retingudes a l'interior del reactor mitjançant un mòdul de microfiltració extern i són cultivades amb una aportació constant de medi, de manera que es garanteix una presència dels diferents nutrients essencials a unes concentracions adequades per a les cèl·lules i s'aconsegueix eliminar els diferents subproductes cel·lulars que podrien esdevenir tòxics, aconseguint així unes condicions el més semblants possibles a les que tindria la cèl·lula in vivo. A partir dels resultats obtinguts s'ha pogut constatar que aquesta estratègia de cultiu permet obtenir elevades concentracions cel·lulars durant períodes de temps superiors als de les altres dues estratègies estudiades, incrementant-se també tant la productivitat com la concentració final d'anticòs monoclonal.

In this thesis the problem of the mammalian cells culture optimisation, more specifically of hybridomas, has been undertaken from the study of application of different cultivation strategies, as the operations in batch, fed-batch, and continuous perfusion. These cultivation strategies have been carried out in a well agitated bioreactor with the aid of monitoring and control tools that they have been utilised to obtain information and to be able to act upon the cellular environment, in the cases that has been necessary. In batch strategy it has been validated the measurements of cellular concentration and cellular activity, utilised to obtain on-line information of the culture state, and the operation has been optimised fortifying the growth medium. Although this is the most extended operation system from industrial point of view, basically by their simplicity, is shown that is clearly sub-optimised, since the cells have been always submitted to a changing environment where culture conditions are unfavourable. Fed-bath strategy has tried to give solution to batch operation problems, changing the cellular metabolism setting the major substrates to low concentration levels, and thus to be able to reduce the production of inhibitors by-products and, therefore, to increase cellular concentration and to extend cell culture life. For this purpose, it is done necessary the use of different nutrients scheme control with the aid of the implemented on-line measurements and the design of concentrated addition solutions. In concrete, the strategies developed gravitate upon two on-line measurements: cellular concentration and oxygen consumption rate, indicative of cellular activity. Nevertheless, although by-products production are reduced and cellular concentration is increased, does not do it in sufficient amount regarding the cell culture made with fortified growth medium and, therefore, the productivity is increased very lightly. To eliminate the problems of batch and fed-batch strategies, the mammalian cells are retained inside of bioreactor by means of an external microfiltration module (hollow fiber) and they are cultivated with a constant medium contribution. By means this strategy the presence of different essential nutrients is guaranteed to adequate concentrations for the cells and is obtained to eliminate the different cellular by-products that would be able toxic, being reached thus similar conditions that would have the cells in vivo. The obtained results has been able to confirm that this cultivation strategy permits to obtain high cell concentrations during long time periods over the other two strategies studied, being increased also so much the productivity as the final monoclonal antibody concentration.