Protecció del procés de mort cel·lular programada en cultius in vitro de cèl·lules animals

Abstract

Davant la impossibilitat econòmica i física de controlar enginyerilment tots els paràmetres involucrats en la pèrdua de viabilitat en cultius in vitro de cèl·lules animals quan es dóna una limitació en el subministrament de nutrients, així com per la presència d'elevades concentracions de subproductes tòxics del metabolisme, en aquest treball s'ha explorat la modificació tant de la formulació del medi com genètica de cèl·lules d'hibridoma amb l'objectiu de perllongar la seva supervivència dins els bioreactors i rendibilitzar el procés d'obtenció d'anticossos monoclonals. <br/>La reformulació del medi va permetre alentir la proliferació cel·lular i retardar l'exhauriment de nutrients essencials. Tanmateix, aquests canvis induïen la mort cel·lular per apoptosi.<br/>El bloqueig de l'apoptosi mitjançant l'ús d'inhibidors peptídics específics de Caspases va permetre no només retardar la pèrdua de viabilitat dels cultius si no també recuperar-los 36 hores després d'haver induït la mort per manca de glutamina. <br/>Resultats similars es van obtenir en la inhibició genètica de l'activació de les Caspases sobreexpressant gens protectors de la família de Bcl-2, tant d'origen endogen com víric. A més a més, els cultius d'aquestes noves línies cel·lulars d'hibridoma poden ser recuperats després d'haver estat sotmesos fins a 48 hores sota condicions inductores de l'apoptosi.<br/>Aquests resultats demostren la viabilitat d'incorporar una vàlvula de seguretat genètica que permet retardar el procés de mort per apoptosi de cèl·lules que, en altres circumstàncies, moririen i s'acumularien en el bioreactor. A més a més, la sobreexpressió de gens antiapoptòtics fa les cèl·lules més resistents i permet recuperar cultius que, per causes accidentals inherents a la metodologia emprada en el monitoratge i control del bioprocés o per limitacions físiques de subministrament de nutrients, factors de creixement i oxigen, es vegin sotmeses a condicions inductores de l'apoptosi. <br/>D'aquesta manera, aquest treball de tesi contribueix a la creació d'un sistema de cultiu més robust que evitaria l'enorme pèrdua de rendibilitat en els processos d'obtenció del producte desitjat quan els cultius entren en la fase de mort per apoptosi

Due to the economical and physical unavailability to control a number of parameters involved in the loss of viability of animal cell cultures as a result of a limitation in nutrient supply, as well as high levels of toxic byproducts, we have explored the effect of medium modification on cell viability as well as the genetic manipulation of hybridoma cells with the aim of prolonging the life span of these cultures in bioreactors and therefore optimize the productivity of monoclonal antibodies.<br/>Reformulation of culture medium allowed a decrease in cellular proliferation and therefore delay nutrient exhaustion. However, these changes induce cell death by apoptosis.<br/>The use of caspase inhibitors has enabled to mantain cell viability during a significant period of time, when glutamine depletion was maintained in the culture. Two caspase inhibitors partially suppressed the progress of PCD under glutamine deprivation: Ac-DEVD-cho and z-VAD-fmk. Indeed, as a consequence of this protection, the number of viable cells decreased by 10% (for z-VAD-fmk) and by 80% (for Ac-DEVD-cmk) after 36 hours of culture, while it decreased by 90% for a control culture in absence of protective compounds. However, when the culture was exposed to non-apoptotic conditions after this period of time under apoptosis protection conditions, normal growth pattern was not recovered. Interestingly, the simultaneous use of both inhibitors made the recovery of the cell culture possible even after a period of 36 hours under glutamine depletion, indicating that the inhibition of the effector caspases occurs upstream of the point in which hybridoma cells enter into the commitment step of the death programme.<br/>Similar results were obtained by genetic inhibition of the Caspase cascade activation by means of overexpression of protector genes of the Bcl-2 family: Bcl-2, Bcl-XL, and viral homolgues BHRF-1 and KSBcl-2. Moreover, cultures of these genetically modified hybridomas could be rescued from cell death phase after a significant period of time (i.e., 24 and 48 h) under apoptosis inducing conditions.<br/>These results show the viability of the incorporation of a security valve that could delay the cell death process by apoptosis in cell cultures which, under other circumstances, would die and be accumulated in the bioreactor. Moreover, overexpression of Bcl-2 homologues make hybridomas more resistant to apoptosis and allow the recovery of viability of cultures deprived from glutamine after 48 hours of apoptosis inducing conditions. <br/>Thus, the present work help towards the creation of a more robust culture system that will avoid tremendous loss of cost-effectiveness of biotechnological processes when cultures of animal cells trigger apoptosis.