Producció de Fuculosa-1-Fosfat aldolasa recombinant en E.coli

Abstract

En l'actualitat es coneix un gran ventall d'enzims naturals capaços de catalitzar la formació d'enllaços caboni-carboni amb estereoquímica definida que obren noves perspectives en el camp de la síntesi asimètrica aportant solucions sintètiques en camps difícils d'abordar des de la perspectiva de la síntesi orgànica convencional. Aquests enzims són bàsicament aldolases i transcetolases. En concret es coneix una família de quatre aldolases depenents de DHAP que catalitzen la formació d'un enllaç C-C amb generació de dos nous centres quirals amb estereoquímica definida i complementària: segons l'aldolasa utilitzada s'obtindrà de forma específica un dels quatre diaestereoisòmers possibles. Aquesta família d'aldolases ha despertat un gran interès com a eina sintètica.<br/>El projecte en que s'emmarca aquesta tesi aposta per l'estudi d'aquest grup de biocatalitzadors i pretén contribuir al desenvolupament pràctic de les aldolases centrant-se en els aspectes de producció dels enzims i en el desenvolupament de metodologia per a la seva utilització en síntesi quiral.<br/>En aquesta memòria de tesi doctoral s'estudia la millora de producció de l'aldolasa Fuc-1-PA en E.coli, com enzim model d'aquesta família d'aldolases depenents de DHAP. L'objectiu és definir un procés optimitzat i reproduïble per a la seva obtenció a escala productiva. Amb aquest objectiu global, es consideren els principals aspectes que condicionen la sobreexpressió de proteïnes recombinants E.coli. Primer, s'estudia la influència de la composició del medi de cultiu en el creixement i sobreexpressió recombinant. Segon, es treballa en el desenvolupament d'una estratègia de cultiu semicontínua adequada per assolir cultius d'alta densitat cel.lular de forma reproduïble. Un cop fixades les condicions d'operació per al creixement segons aquesta estratègia semicontínua, és possible definir els criteris d'inducció per maximitzar la producció de Fuc-1-PA al procés. Finalment, s'aborda la millora genètica del procés provant un nou sistema d'expressió recombinant desenvolupat pensant en la seva aplicació a escala de producció.

Nowadays, a considerable number of wild-type enzymes catalazing formation of stereo chemically defined C-C bond as natural function have been discovered. These enzymes have opened new possibilities in quiral chemistry field as they could mean a solution for problems impossible to be solved right now with conventional organic chemistry alternatives. These enzymes are, basically, aldolases and transketolases. It is important to point here out that it is known a four members DHAP dependent aldolases family which is able to catalyze the formation of a new C-C bond which results in the formation of two new quiral centers with complementary and perfectly defined stereochemistry. Hanging on the aldolase employed in the new C-C bond synthesis it is obtained specifically one of the four possibles diastereoysomers. This family has been considered really interesting as synthetic tool.<br/>The project this thesis work is related to, is focused on the study of these biocatalyzers group and its main goal is the practical knowledge of aldolases: learn new techniques for maximize their production and make it possible their final application as quiral synthetic tools.<br/>In this work, improvements in Fuculose-1-phosphate aldolase production are studied, as enzyme model of this four members family. The final goal fixed for this work is define a optimizated and reproducible process for its production at industrial scale. To obtain this final goal, here are studied the most important points affecting recombinant proteins production in E. coli. First, study of growth media composition influence in growth and recombinant overexpression. Second, search of a new semi-continues fermentation strategy which allows obtain high cell density cultures in a reproducible way. Once, growth conditions have been fixed related to this new semi continues fermentation strategy, it is possible to work on induction criteria definition in order to maximize Fuc-1-FA production. Finally, work has been focused on genetic improvement of the process. We have tested a new recombinant expression system for industrial scale application: ORT expression System.