Estratègies d'operació en el procés de producció de proteïnes heteròlogues en Pichia pastoris: aplicació de tècniques de monitorització i control

Abstract

El desenvolupament de bioprocessos productius reproduïbles i escalables s'ha convertit en un dels colls d'ampolla a mesura que es consolida l'obtenció de proteïnes recombinants. Per poder superar-ho, la FDA i la EMEA han posat en marxa la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que cerca el desenvolupament de processos productius eficients i controlats i que serveix de marc pel desenvolupament del present treball.<br/>El treball desenvolupat te com a objectiu el desenvolupament i implementació d'eines que permetin monitoritzar i controlar els processos de producció amb el llevat metilotròfic P. pastoris. <br/>Aquest objectiu es materialitza en forma de un desenvolupament d'eines per la correcta monitorització de paràmetres i variables associats al procés productiu, com són el desenvolupament d'un sistema automàtic de presa de mostra, el desenvolupament d'eines per a l'eliminació d'interferències per un sensor en línea de metanol, el desenvolupament d'un sistema en línea de compostos amínics i el desenvolupar un software sensor que permeti determinar en línea la velocitat específica de creixement de P. pastoris en base a un algoritme d'identificació RLS. A més a més, s'ha implementat un sistema de control per a poder analitzar l'efecte de la concentració de metanol en una soca de fenotip Mut+ de P. pastoris sobre la productivitat del procés productiu i posteriorment s'ha avaluat l'efecte de la utilització de substrats mixtes per a la producció de proteïnes recombinants pels fenotips Muts i Mut+ de P. pastoris.<br/>Paraules clau<br/>Discontinu alimentat, Pichia pastoris, substrats mixtes, bioprocés, control, optimització, RLS

El desarrollo de bioprocesos productivos reproducibles y escalables se ha convertido en uno de los cuellos de botella a medida que se consolida la obtención de proteínas recombinantes. Para poder superarlo, la FDA y la EMEA han puesto en marcha la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que busca el desarrollo de procesos productivos eficientes y controlados y que sirve de marco para el desarrollo del presente trabajo.<br/>El trabajo desarrollado tiene como objetivo el desarrollo e implementación de herramientas que permitan monitorizar y controlar los procesos de producción de la levadura metilotrófica P. pastoris. <br/>Este objetivo se materializa en forma de un desarrollo de herramientas para la correcta monitorización de parámetros y variables asociadas al proceso productivo, como son el desarrollo de un sistema automático de toma de muestra, el desarrollo de herramientas para la eliminación de interferencias para un sensor en línea de metanol, el desarrollo de un sistema en línea de medida de la concentración de compuestos amínicos y el desarrollo de un software sensor que permita determinar en línea la velocidad específica de crecimiento de P. pastoris en base a un algoritmo de identificación RLS. Además, se ha implementado un sistema de control para poder analizar el efecto de la concentración de metanol en una cepa de fenotipo Mut+ de P. pastoris sobre la productividad del proceso productivo y posteriormente se ha evaluado el efecto de la utilización de sustratos mixtos en la producción de proteínas recombinantes para los fenotipos Muts y Mut+ de P. pastoris.<br/>Palabras Clave<br/>Discontinuo alimentado, Pichia pastoris, substratos mixtos, bioproceso, control, optimización, RLS

The development of reproducible and scalable productive bioprocesses has become one of the bottlenecks for the production of recombinants proteins. In order to overcome it, the FDA and the EMEA have started off the Process Analytical Technologies (PAT). That initiative looks for the development of efficient and controlled productive processes and is in this concept where the present work is framed.<br/>The goal of this experimental work is the development and implementation of tools that allow monitorization and control of P. pastoris production processes.<br/>This goal is materialized with the creation and implementation of tools for the correct monitorization of parameters and state variables of the productive process, such as the development of an automatic sampling system, the development of tools for the elimination of interferences of an on-line methanol sensor, the development of an amine compounds analyzer and the development of a sensor software that allows to gauge the specific growth rate of P. pastoris using a RLS identification algorithm. Moreover, a methanol control system has been implemented for analyzing the effect of the substrate concentration in the productivity on a P. pastoris (phenotype Mut+) culture. And finally it has been analyzed the effect of mixed substrate strategy in Muts and Mut+ phenotypes of P. pastoris for the production of recombinant proteins. <br/>Key words<br/>Fed-batch, Pichia pastoris, mixed substrates, bioprocess, control, optimization, RLS.