Producció recombinant de la gonadotrofina coriònica equina amb el llevat Pichia pastoris

Abstract

En aquest estudi es presenta el procés d'obtenció d'una proteïna recombinant, l'hormona gonadotrofina coriònica equina (eCG) en el llevat metilotròfic Pichia pastoris.<br/>S'ha sintetitzat els gens mitjançant la tècnica de PCR, ja que les seqüències són relativament curtes, 294 i 472 nucleòtids pels gens codificadors de la cadena &#945; i &#946;, respectivament. Això ha permès poder modificar la seqüència per tal d'adaptar-la a l'ús codons més utilitzats per P. pastoris, eliminar i afegir dianes de restricció per facilitar el clonatge, eliminar la seqüència senyal pròpia i treure els introns que conté la seqüència genòmica de la cadena &#946;.<br/>D'acord amb la seqüència de DNA optimitzada obtinguda s'han dissenyat una sèrie d'oligonucleòtids amb una petita part de seqüència solapada que serviran per la síntesi de cada un dels dos gens. La tècnica de PCR ha permès la fusió d'aquests oligonucleòtids per obtenir els dos gens, els quals s'han clonat al plasmidi d'expressió pPICZ&#945; sota el control del promotor AOX.<br/>A partir dels plasmidis que contenen només un dels dos gens s'han obtingut dues construccions que contenen els dos cassets d'expressió en els dos ordres possibles: pPICZ&#945;-eCG&#945;+&#946; i pPICZ&#945;-eCG&#946;+&#945;.<br/>S'han obtingut cinc transformants amb cada construcció, se n'ha avaluat la seva capacitat productiva amb cultius en erlenmeyer i una transferència de punts. S'han fet cultius en discontinu i en discontinu alimentat per produir suficient hormona per poder desenvolupar un procés de purificació i poder caracteritzar parcialment l'hormona recombinant. <br/>La cua de 6 histidines present en la cadena &#945; hauria de permetre fer una purificació en un sol pas amb una cromatografia d'afinitat amb metalls quelants, però no ha estat així; la proteïna era incapaç d'unir-se a la resina i per tan, no s'ha pogut separar de la resta de proteïnes del brou mitjançant aquesta tècnica.<br/>Per això s'ha plantejat un procés de purificació més complex, tot i que s'ha procurat minimitzar-ne el nombre d'etapes. La concentració inicial del brou obtingut permet treballar amb volums més reduïts. Segueix una diafiltració que permet disminuir l'alt contingut en sals del brou de cultiu i tenir la proteïna en un tampó estàndard. D'aquesta manera també s'han eliminat les proteïnes de pes molecular més petit de 10 kDa.<br/>Segueixen dues etapes de cromatografia, la primera de bescanvi iònic i la segona ha estat de sedàs molecular. Amb aquest procés s'ha aconseguit un producte final suficientment pur, tot i que alguns dels resultats de la caracterització apunten que encara hi pot haver quedat alguna proteïna no desitjada de propietats físico-químiques molt semblants a la eCG.<br/>S'ha caracteritzat, breument, l'hormona recombinant parcialment purificada, comparant-la amb l'hormona nativa. S'ha determinat el pes molecular, el punt isoelèctric i el grau de glicosilació.<br/>Amb una preparació de eCG recombinant en solució salina s'han fet les proves d'activitat in vitro, que han donat positives i d'activitat in vivo, que han donat negatives.<br/>Així doncs, podem dir que s'ha aconseguit produir l'hormona eCG amb el llevat P. pastoris, tot i que falta perfeccionar el procés de purificació per a obtenir-la en quantitat i qualitat adequada.

In this study, the process of obtaining the recombinant protein equine Chorionic Gonadotrophin hormone (eCG) in the methylotrophic yeast Pichia pastoris is presented.<br/>The genes have been synthesized through the technique of PCR, since the sequences are relatively short, 294 and 472 nucleotides for the genes coding the alpha and beta chain, respectively. This has allowed to modify the sequence in order to adapt the sequence to the more used by P. pastoris, to eliminate and to add targets of restriction to improve the cloning, to eliminate the own signal sequence and to remove the introns that the genomic sequence contains.<br/>In accordance with the optimized sequence of DNA, we design four oligonucleotides for each chain, with a small part of overlapped sequence that will serve for the synthesis of each alpha and beta gene. The technique of PCR has allowed the fusion of these oligonucleotides. The genes have been cloned in pPICZ&#945;, a expression plasmid where the expression is under the control of the promoter AOX.<br/>From the plasmids that content only one of the genes, we construct the plasmids that content both cassettes of expression in the two possible orders: pPICZ-eCG&#945;+&#946; and pPICZ-eCG&#946;+&#945;.<br/>Five transformants have been obtained with each construction, its productive capacity with erlenmeyer culture has been estimated.<br/>Cultures have been made in batch and in fed-batch for producing enough hormone for being able to develop a process of purification and being able to characterize partially the recombining hormone.<br/>The presents of 6 histidines tag in the alpha chain should allow to make a purification in one step by an affinity chromatography, but it has not been possible; the protein was incapable of joining to the resin and for so, it has not been able to break away from the rest of proteins of the broth.<br/>Because of that, a process of purification more complex has been brought up; even though it has been tried to minimize the number of stages. The initial concentration of the broth allows to work with more reduced volumes. A diafiltration allows to reduce the high concentrations of salts from the medium culture and to have the protein in a standard buffer. In this way also the proteins of smaller molecular weight (10 kDa) have been eliminated.<br/>Two stages of chromatography follow the concentration; the first is a ionic exchange and the second is a gel-filtration chromatography. With this process a final product pure enough has been achieved, even though some of the results of the characterization aim that some protein is not eliminated, a protein with Physico-chemical properties very similar to the eCG.<br/>The recombinant hormone partially purified is briefly characterized and it is compared with the native hormone. The molecular weight, the isoelèctric point and the degree of glycosylation have been determinate. With the same recombinant hormone the in vitro and in vivo activity has been analyzed, the first one gives us a positive result but not the second one.<br/>So, we can say that it has been achieved to produce the hormone eCG with the yeast P. pastoris, even though an improve of the process of purification in needed to obtain a recombinant product in a suitable quality.