Caracterización molecular de especies ocratoxígenas del género Aspergillus sección Nigri

Abstract

la presente Memoria de Tesis Doctoral se ha estudiado la micobiota de la uva en diferentes períodos de maduración, con el objetivo de identificar las especies ocratoxígenas presentes. Para ello se han muestreado 7 viñedos distintos, situados principalmente en la costa Mediterránea española, durante los años 2001, 2002 y 2003. Asimismo, se ha analizado la capacidad de producir ocratoxina A de las cepas potencialmente productoras aisladas en este muestreo. Por otro lado, se han caracterizado a nivel molecular 226 cepas del género Aspergillus sección Nigri potencialmente ocratoxígenas. Todas las cepas del estudio molecular son aislamientos de uva de distintos orígenes geográficos: España, Francia, Grecia, Israel, Italia y Portugal.<br/>La micobiota predominante de la uva de los viñedos españoles muestreados perteneció a los géneros Alternaria, Cladosporium y Aspergillus, mientras que el género Penicillium representó menos del 3% de los aislamientos. La elevada incidencia de Alternaria spp. y Cladosporium spp. en los primeros períodos de muestreo decreció con la maduración de la uva, mientras la presencia de Aspergillus spp. incrementó significativamente. En todos los casos, se encontraron diferencias significativas en la incidencia de estos géneros en cada período de muestreo. Durante los tres años de muestreo, se aislaron de las uvas un total de 1812 cepas de Aspergillus spp., de entre las cuáles solamente 13 fueron identificadas como A. ochraceus, mientras que 1423 se identificaron como pertenecientes al agregado A. niger, y 226 como A. carbonarius. El único aislamiento identificado como P. verrucosum entre las 214 cepas de Penicillium spp. aisladas mostró la capacidad de producir citrinina, pero no OA. Los aislamientos pertenecientes a Aspergillus sección Nigri representaron alrededor del 90% del total de cepas del género aisladas. Aunque se presentaron en todas los períodos de muestreo, la presencia de las especies del agregado A. niger y de A. carbonarius fue significativamente superior en la vendimia. Por otra parte, el número de aislamientos en el medio DRBC fue superior que en MEA, si bien estas diferencias no resultaron significativas. Las pepitas de uva analizadas no presentaron contaminación fúngica, por lo tanto se asume que la contaminación con hongos productores de OA en la uva proviene de la superficie del fruto.<br/>En cuanto a los resultados obtenidos en el estudio de producción de OA de las cepas aisladas de viñedos españoles, se ha evidenciado la importante contribución de A. carbonarius en la contaminación por OA en uva, y por tanto, en el vino. Esta afirmación se deriva no sólo de la elevada incidencia que presenta esta especie en las uvas, especialmente en la vendimia, sino también del porcentaje de cepas productoras, un 100% en este estudio. En cuánto a las otras especies de Aspergillus sección Nigri aisladas, solamente el 0,7% de los aislamientos del agregado A. niger resultaron ser ocratoxígenos, mientras que ninguno de los aislamientos uniseriados produjeron OA. También se detectó la producción de OA por otras especies de Aspergillus no pertenecientes a la sección Nigri. Algunas de estas especies producen OA en grandes cantidades, pero su baja incidencia en la uva hace que su importancia como fuentes de contaminación sea escasa. <br/>En relación al estudio molecular de A. carbonarius, se han caracterizado mediante RAPD y secuenciación de la región ITS-5.8S del rDNA 53 cepas aisladas de uva de diferentes países europeos. Cuarenta y nueve de las cepas presentaron un patrón de RAPD muy similar y la secuencia de la región ITS-5.8S prácticamente idéntica. Todas estas cepas produjeron OA en distintas cantidades. Las 4 cepas restantes mostraron un patrón de RAPD diferente y la secuencia de la región ITS-5.8S distinta a las demás, además de ser las únicas cepas no productoras de OA. Estos aislamientos podrían representar una nueva especie dentro de la sección Nigri. Por otra parte, en el estudio molecular del agregado A. niger se han caracterizado 173 cepas procedentes de distintos orígenes geográficos, mediante una técnica de RFLP de la región ITS-5.8S del rDNA. Todas las cepas se agruparon en los 2 patrones de RFLP descritos previamente: tipo N (43% de las cepas) y tipo T (57% de las cepas). Se detectó la producción de OA en 20 de las 173 cepas (11,6%). Todas las cepas ocratoxígenas mostraron el patrón tipo N.

The objective of the study was to identify the ochratoxin A (OA) producing mycobiota of grapes at different developmental stages of the berries. During 2001, 2002 and 2003 season, a total of 7 vineyards located mainly along the Mediterranean coast of Spain were studied. Besides, OA-producing ability of the isolates of potentially ochratoxigenic species was analyzed. Furthermore, 226 strains belonging to Aspergillus section Nigri were characterized by molecular methods. All these strains were isolated from grapes from different geographic origins, as Spain, France, Greece, Israel, Italy and Portugal. <br/>Predominant mycobiota of grapes belonged to Alternaria spp., Cladosporium spp. and Aspergillus spp., Penicillium spp. represented less than 3% of the isolates. With the maturation of berries, the incidence of Alternaria spp. and Cladosporium spp decreased while there was a clear increase of Aspergillus spp. In all cases, statistically significant differences were found in the occurrence of those genera at each sampling time. During the 3 years of the study, a total of 1812 isolates of Aspergillus spp. were recovered from grapes, of these, 1423 isolates belonged to A. niger aggregate and 226 were A. carbonarius isolates. Only 13 isolates of A. ochraceus were identified. A total of 214 isolates belonging to Penicillium spp. were recovered from berries. The sole isolate of P. verrucosum identified was able to produce citrinin but did not produce OA. Isolates belonging to Aspergillus section Nigri constituted about 90% of the total Aspergillus isolates. Although they were recovered in all the stages sampled, there was a statistically significant increase at harvesting. Even though the number of isolates recovered in DRBC medium were higher than on MEA, these differences were not statistically significant. No fungal growth was obtained from the seeds removed from berries. This leads to the assumption that contamination by OA-producing species comes from the surface of the berries and not from the inner fruit.<br/>The results of the OA production ability studies are a strong evidence of the contribution of A. carbonarius in the OA contamination in grapes, and consequently in wine. This is supported not only by its important role in the mycobiota of grapes, especially at harvest, but also by the extremely high ability to produce OA. In this study, all the A. carbonarius isolates recovered from berries were able to produce OA whereas only 0.7% of the isolates belonging to the A. niger aggregate were ochratoxigenic. None of the uniseriate isolates of the section Nigri produced OA. Other Aspergillus species outside section Nigri were ochratoxigenic. Although some of these species were able to produce OA in large quantities, they are probably a relatively unimportant source of this mycotoxin in grapes due to their low occurrence.<br/>Furthermore, 53 strains of A. carbonarius from different countries were characterized by RAPD and ITS-5.8S rDNA sequencing analysis. Forty-nine strains had a similar RAPD pattern and identical ITS-5.8S rDNA sequences. They produced OA at different levels. Only four strains were unable to produce OA. These strains showed a different RAPD pattern, and the section of DNA sequenced differed from the sequence of the other 49 strains. These OA-non producing strains may represent a new species in the Aspergillus section Nigri. Besides, 173 strains belonging to A. niger aggregate were characterized by RFLP analysis of the ITS-5.8S rDNA region. All of the strains were classified into the two RFLP patterns previously defined: type N (43%) and type T (57%). Twenty out of the 173 strains produced OA (11.6%). All the OA-producing strains belonged to N type.