Aspergillus sección Nigri: estudio fisiológico y molecular de especies ocratoxígenas

Abstract

La presente Memoria de Tesis Doctoral, presentada en forma de compendio de publicaciones, recoge el estudio fisiológico y molecular realizado con especies del género Aspergillus sección Nigri productoras de ocratoxina A (OTA). Esta micotoxina está recibiendo una especial atención en todo el mundo debido a su marcado carácter nefrotóxico. Además, es una sustancia carcinógena, teratógena e inmunotóxica y desde el año 2002, la UE ha comenzado a establecer niveles máximos de esta micotoxina en algunos alimentos. Estudios muy recientes han puesto claramente de manifiesto la implicación de algunas especies del género Aspergillus de la sección Nigri (A. carbonarius y las incluidas en el "agregado A. niger") en la presencia de OTA en alimentos como la uva, las pasas y el vino, entre otros. No obstante, no se conocen hasta el momento las condiciones ambientales que favorecen la producción de la micotoxina por estas especies.<br/>En los modelos fisiológicos utilizados, se han incluido cepas de A. carbonarius y del agregado A. niger, seleccionadas en base a su diferente origen y capacidad ocratoxígena. Se ha estudiado el efecto del sustrato (medios CYA y YES), la temperatura (5-45ºC), la actividad de agua (aw) (0,78-0,99) y el pH (2-10) en el crecimiento y la producción de OTA. Asimismo, se ha analizado la relación filogenética de las cepas estudiadas mediante diferentes técnicas de biología<br/>molecular (RFLP, RAPD, secuenciación, ERIC-PCR, AFLP y microsatélites). Los resultados obtenidos han permitido determinar las condiciones óptimas para la producción de OTA en las cepas del agregado A. niger (medio YES a 20-25ºC en el intervalo 0,96-0,99 aw y pH 5-10) y en las de A. carbonarius (medio CYA a 15-20ºC en el intervalo 0,98-0,99 aw y pH 5-7). En relación a la caracterización molecular de las cepas estudiadas, las técnicas de RAPD y secuenciación confirman la separación del agregado A. niger en dos grupos que se corresponden con los patrones de RFLP (N y T) establecidos previamente. En el caso de A. carbonarius estas técnicas han permitido la diferenciación molecular de una de las cepas estudiadas. Esta cepa pertenecería a la nueva especie propuesta dentro de la sección Nigri, denominada "A. ibericus".<br/>Las técnicas ERIC-PCR, AFLP y microsatélites han resultado útiles para la caracterización molecular de las especies estudiadas. Los resultados más significativos se han obtenido mediante AFLP y el análisis de microsatélites, permitiendo ambos la diferenciación de las cepas del agregado A. niger en dos grupos que se corresponden con los patrones de RFLP N y T.<br/>Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la capacidad de las cepas del agregado A. niger y A. carbonarius para crecer y elaborar OTA en amplios márgenes de temperatura, pH y actividad de agua. Esta capacidad permite explicar el papel que juegan estas especies ocratoxígenas en la presencia de esta micotoxina en los alimentos y especialmente en aquellos donde constituyen la micobiota predominante.

The present work, presented as compendium of publications, is focused on the physiology and molecular study of species within Aspergillus section Nigri (black aspergilli) able to produce ochratoxin A (OTA). This mycotoxin is achieving an increasing attention worldwide due to its acute nephrotoxicity. It is also carcinogenic, teratogenic and is clearly an immunosuppressive agent. Since 2002 the European Commission has established limits for OTA in some food commodities. Recently, several studies have highlighted the involvement of several species of black aspergilli (A. carbonarius and A. niger aggregate) in the presence of OTA in food commodities such as grapes, raisins and wine. However, the environmental conditions which support the production of this mycotoxin by these species are still unknown.<br/>Strains of A. carbonarius and A. niger aggregate, selected to include different sources and ochratoxigenic abilities, have been included in the physiology study. The effect of substrate (CYA and YES media), temperature (5-45ºC), water activity (aw) (0.78-0.99) and pH (2-10) has been studied. Analysis of genetic relationships within the studied strains has been also performed through different molecular techniques (RFLP, RAPD, sequencing, ERIC-PCR, AFLP and microsatellites).<br/>The results obtained show the optimal conditions for the production of OTA in A. niger aggregate strains (YES medium, 20-25ºC, 0.96-0.99 aw and pH 5-10) and in A. carbonarius strains (CYA medium 0.98-0.99 aw and pH 5-7). With regard to the molecular characterization of the studied strains, RAPD and sequencing techniques confirm the division of the A. niger aggregate into two groups which correspond with the previously described RFLP patterns (N and T). In the case of A. carbonarius one strain differs from the rest and it may belong to the new species proposed in section Nigri, "A. ibericus". The molecular markers ERIC-PCR, AFLP and microsatellites have been useful to characterize the studied species. The most significant results have been obtained through AFLP and microsatellites. Both markers make possible the differentiation of the A. niger aggregate strains in two groups which correspond with the two RFLP patters N and T.<br/>The results obtained state the ability of A. niger aggregate and A. carbonarius strains to grow and produce OTA in wide ranges of temperature, pH, and water activity. This ability let understand the role of these ochratoxigenic species in the presence of this mycotoxin in food commodities, especially in those where they are the predominant isolated fungi.