Functional implications of protein kinase CK2 in F-actin dynamics and in the cross-talk between auxin and salicylic acid signalling pathways in arabidopsis thaliana

Abstract

El objetivo de esta tesis era el estudio del papel de la proteina CK2 en tres procesos biológicos de plantas, utilizando Arabidopsis thaliana como modelo: fototropismos, regulación de las vías de señalización del ácido salicílico y de las auxinas, y dinámica del citoesqueleto de actina. Un mutante de pérdida de función de CK2 (CK2mut) obtenido por otros miembros del laboratorio, que mostró rasgos fenotípicos relacionados con alteraciones en procesos dependientes de auxinas, ha sido la herramienta principal utilizada en esta tesis. Tras el tratamiento con luz azul, el mutante mostró una pérdida de la respuesta fototrópica en hipocotilos y un aumento de la curvatura fototrópica de la raíz. Por otra parte, la internalización de PIN2 en compartimentos vacuolares, que normalmente ocurre cuando las plántulas se transfieren a oscuridad, estaba ausente en las plántulas CK2mut, aunque el reciclaje de PIN2 a la membrana plasmatica no se veía afectado. Para comprender mejor la regulación de la señalización por auxinas en plantas defectivas en CK2 estudiamos la estabilidad de las proteínas AUX/IAA, que son represoras de las vías de señalización de auxinas y modulan las respuestas de auxinas. Demostramos que la inhibición de CK2 dio como resultado un aumento de la estabilidad del represor AXR3. Como las plántulas CK2mut contienen niveles de ácido salicílico (SA) anormalmente elevados, estudiamos también la regulación cruzada (crosstalk) entre la señalización por auxina y por SA, y demostramos que el aumento de estabilidad de AXR3 estaba mediada por SA. Los estudios in vivo por microscopía confocal de la arquitectura de actina en células de la raíz se realizaron utilizando el reporter de actina GFP-FABD2. Las células del mutante de CK2 mostraron una fuerte desorganización de la estructura reticular y un colapso de los haces de F-actina. Se realizaron estudios de turnover de actina que confirmaron que la falta de actividad de CK2 afectaba fuertemente a la polimerización de los filamentos de actina. El turnover de F-actina está regulado por proteínas de unión a actina, entre ellas la familia de los factores de despolimerización de actina (ADF). Utilizando herramientas de bioinformática, encontramos algunos sitios putativos de fosforilación para CK2 en la secuencia aminoacídica de ADF4. Ello podría indicar que la CK2 podría regular la actividad de ADF4, involucrada en el desensamblaje del filamento de actina.

The aim of this thesis was the study of the role of protein kinase CK2 in three plant biological processes, using Arabidopsis thaliana as a model: plant phototropisms, regulation of salicylic acid and auxin signalling pathways, and dynamic of actin cytoskeleton. A loss-of-function mutant of CK2 (CK2mut), obtained by former members of the laboratory and that showed phenotype traits linked to alterations in auxin dependent processes, was used as the main tool for our studies. In the present work we show that CK2mut seedlings exhibit loss of the hypocotyl phototropic response and increase of the root phototropic curvature under blue light treatments. Moreover, PIN2 internalization into vacuolar compartments after transferring CK2mut seedlings to darkness did not occur when CK2 activity was depleted, although PIN2 recycling to the plasma membrane was not affected. In order to better understand auxin-signalling regulation in CK2-defective plants we studied the stability of AUX/IAA proteins, which are repressors of auxin signalling pathways and modulate responses to auxin. We performed histochemical and fluorimetric assays and we demonstrated that inhibition of CK2 resulted in over-stabilization of the AXR3 repressor. As CK2mut seedlings contain high levels of salicylic acid (SA), we then studied the cross-talk between auxin and SA pathways and we demonstrated that the over-stabilization of AXR3 in CK2- defective plants is mediated by SA. In vivo confocal imaging of actin architecture was performed by using the actin reporter GFP-FABD2. CK2-depleted seedlings showed strong disorganization of the actin network and collapse of F-actin bundles. Studies of actin turnover in Arabidopsis seedlings confirmed that the lack of CK2 activity strongly affects polymerisation of actin filaments. F-actin turnover is regulated by actin binding proteins, among them the family of actin depolymerisation factors (ADFs). In our study, we found some putative predicted phosphorylation sites for CK2 in ADF4. Thus, we can speculate that CK2 might be involved in the regulation of the ADF4 actin filament disassembly activity.