Estudio de la inactivación por ultra alta presión de homogeneización de microorganismos en alimentos líquidos. Valoración de los procesos de limpieza y desinfección del equipo

Abstract

El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue evaluar la inactivación bacteriana usando Ultra Alta Presión de Homogeneización (UHPH) a 300 + 30 MPa de las cepas Listeria innocua ATCC 33090, Escherichia coli ATCC 10536, Escherichia coli O157:H7 CCUG 44857, Staphylococcus aureus ATCC 13565 y Staphylococcus carnosus CECT 4491 inoculadas en leche entera, leche desnatada y zumo de naranja. También, intentamos estudiar el efecto de la temperatura de entrada de la leche y del zumo en la máquina de alta presión sobre la letalidad y producción de daños subletales en estos microorganismos, así como la habilidad de estos para sobrevivir, recuperarse y crecer en condiciones de refrigeración después del tratamiento de UHPH. Dado que no existían protocolos previos de limpieza y desinfección de la máquina de UHPH que garantizara la correcta desinfección entre un ensayo y otro, el experimento 1 tuvo como objetivo evaluar la eficacia bactericida como reducción decimal (DR) de una mezcla de ácido peracético y peróxido de hidrógeno (PAHP) contra cepas de Staphylococcus, Listeria y Escherichia coli en presencia de diferentes tipos de materia orgánica, tiempos de exposición y concentración de desinfectante. También se desarrollo de un procedimiento de limpieza y desinfección eficiente adaptado a la máquina de UHPH. Una vez ajustado y evaluado, el proceso de desinfección, el experimento 2 tuvo como finalidad evaluar la eficacia bactericida de los tratamientos de UHPH contra Listeria innocua ATCC 33090 inoculada en leche entera UHT y zumo de naranja UHT, así como estudiar el efecto de la temperatura de entrada en la máquina sobre la letalidad y la producción de daños subletales en este microorganismo. Así mismo se estudió su habilidad de sobrevivir, repararse y crecer almacenado en refrigeración después del tratamiento de UHPH. Los experimentos 3 y 4 tuvieron como objetivo evaluar la inactivación por UHPH de Escherichia coli ATCC 10536 y Escherichia coli O157:H7 CCUG 44857 inoculadas en leche entera UHT, leche desnatada UHT y zumo de naranja UHT, considerando el efecto de la temperatura de entrada de la leche y el zumo, en los valores de letalidad y la capacidad del tratamiento de producir daños subletales en estas cepas. También estudiamos la habilidad de estos microorganismos de sobrevivir, repararse y crecer durante su conservación a 4,0 ºC tras el tratamiento de UHPH. El experimento 5 tuvo como propósito evaluar la inactivación inducida por UHPH en Staphylococcus aureus ATCC 13565 y Staphylococcus carnosus CECT 4491 inoculados en leche entera UHT y zumo de naranja UHT, considerando el efecto de la temperatura de entrada de la muestra en los valores de letalidad, así como la producción de daños subletales en estas cepas, y su capacidad de sobrevivir, repararse y crecer almacenados a bajas temperaturas tras el tratamiento de UHPH. Con respecto a la evaluación del desinfectante, Staphylococcus spp. mostró mayor resistencia a bajas concentraciones de desinfectante que las cepas de Escherichia coli y Listeria spp. El huevo fue la materia orgánica con mayor capacidad interferente mientras que el zumo de naranja presentó la menor capacidad interferente. Sin embargo, el PAHP fue efectivo (reducciones > 5 log UFC/mL) a concentraciones superiores a 0,1 % y 10 minutos de exposición, en todos los casos. No fueron encontradas diferencias estadísticas entre cepas patógenas y no patógenas del mismo grupo. En cuanto a los tratamientos de inactivación por UHPH, en Listeria innocua ATCC 33090, tanto la temperatura de entrada como el tipo de matriz influenciaron significativamente (P ≤ 0,05) su inactivación, que fue mayor a una temperatura de entrada de 20 ºC. Los tratamientos por UHPH no causaron daños subletales en Listeria innocua. Durante el almacenamiento a 4 ºC después de los tratamientos, los recuentos de Listeria innocua en leche aumentaron alrededor de 2 unidades logarítmicas entre los días 0 y 9, mientras que en zumo de naranja disminuyeron 2,5 unidades logarítmicas entre los días 0 y 18. El nivel de inactivación fue similar para ambas cepas de Escherichia coli en leche y no fueron detectados daños subletales después de los tratamientos tanto en leche como en zumo de naranja. La temperatura de entrada así como el tipo de matriz influenciaron (P ≤ 0,05) el grado de inactivación en las cepas de Escherichia coli, alcanzando su máximo nivel a una temperatura de entrada de 20 ºC. La evolución de los recuentos viables durante el almacenamiento a 4,0 ºC de muestras presurizadas fue similar en leche entera y desnatada, aunque la cepa E. coli ATCC 10536 no mostró diferencias significativas entre los días 0 y 9 de almacenamiento, mientras que la cepa E. coli CCUG 44857 mostró una tendencia decreciente de aproximadamente 0,3 unidades logarítmicas. En zumo de naranja, las cepas de Escherichia coli mostraron una mayor tendencia decreciente y la cepa CCUG 44857 fue más resistente al bajo pH, manteniendo recuentos altos para el día 27. En cepas de Staphylococcus, la temperatura de entrada, la matriz y la cepa influenciaron significativamente (P ≤ 0,05) el nivel de inactivación, alcanzando sus mayores niveles a 20 ºC. No se observaron daños subletales tras los tratamientos en ninguno de los casos. La evolución de los recuentos viables de ambas cepas mostró una fuerte tendencia decreciente después del día 3 de almacenamiento a 4,0 ºC en zumo de naranja, mientras que la cepa Staphylococcus carnosus CECT 4491 mostró una baja tendencia y una gran resistencia cuando fue inoculada en leche y presurizada a bajas temperaturas. El PAPH fue efectivo contra todas las cepas probadas a concentraciones por encima de 0,1 % y tiempos de exposición superiores a 10 minutos para todos los tipos de materias orgánicas estudiadas. Los tratamientos de UHPH de leche entera, desnatada y zumo de naranja a 300 + 30 MPa y una temperatura de entrada de 6 y 20 ºC fueron eficientes para reducir los recuentos viables de Listeria innocua ATCC 33090, Escherichia coli ATCC 10536, Escherichia coli O157:H7 CCUG 44857, Staphylococcus aureus ATCC 13565 y Staphylococcus carnosus CECT 4491. La letalidad incrementó con la temperatura de entrada, sugiriendo un claro efecto de la temperatura en los valores de letalidad. El tipo de matriz influenció significativamente tanto la eficacia de los tratamientos de UHPH como la capacidad de crecimiento durante el subsiguiente periodo de almacenamiento a bajas temperaturas. Los tratamientos de UHPH no causaron daños subletales aparentes en ninguno de los casos. La tecnología de las UHPH puede ofrecer una prominente alternativa para la pasteurización de la leche, zumos y otros alimentos líquidos combinado con la posibilidad de incrementar la temperatura de entrada de las muestras antes del proceso.

The main objective of this Doctoral Thesis was to evaluate the bacterial inactivation using Ultrahigh-pressure Homogenisation (UHPH) to 300 + 30 MPa of Listeria innocua ATCC 33090, Escherichia coli ATCC 10536, Escherichia coli O157:H7 CCUG 44857, Staphylococcus aureus ATCC 13565 and Staphylococcus carnosus CECT 4491 inoculated into whole milk, skim milk and into orange juice. Also, we intended to study the effect of inlet temperature of the milk and orange juice in the machine on the lethality and production of sublethal injuries in these microorganisms and its ability for survival, repair and growth in refrigerated storage after UHPH treatment. The objective of experiment 1 was to evaluate the bactericidal efficacy as decimal reduction (DR) of a mixture of peracetic acid and hydrogen peroxide (PAHP) against strains of Staphylococcus, Listeria and Escherichia coli in presence of different organic matter types, exposure times and disinfectant concentrations. Also, we develop an efficient procedure of cleaning and disinfection adapted to the UHPH machine. Experiment 2 had the purpose of evaluating the bactericidal efficacy of UHPH treatments against Listeria innocua ATCC 33090 inoculated into UHT milk and UHT orange juice. We also studied the effect of inlet temperature on the degree of inactivation of this microorganism and the capacity of this UHPH treatment to cause sublethal injuries when inoculated into whole milk and orange juice. We also determined its ability for survival, repair and growth under refrigeration after the UHPH treatment. The experiments 3 and 4 had as objective to evaluate the inactivation by UHPH of Escherichia coli ATCC 10536 and Escherichia coli O157:H7 CCUG 44857 inoculated into UHT whole milk, UHT skim milk and UHT orange juice considering the effect of inlet temperature on the lethality values and the production of sublethal injuries in these strains. We also studied the ability of the microorganisms to repair and growth during storage at 4.0 ºC after treatment. The experiment 5 had as purpose to evaluate the inactivation induced by UHPH of Staphylococcus aureus ATCC 13565 and Staphylococcus carnosus CECT 4491 inoculate into UHT whole milk and UHT orange juice considering the effect of inlet temperature of sample on the lethality values reached and the production of sublethal injuries in these strains, as well as their ability to survive, repair and growth when stored at low temperatures after UHPH treatments. In the evaluation of the disinfectant, Staphylococcus spp. showed more resistance at low concentrations of disinfectant than strains of E. coli and Listeria spp. Egg was the organic matter with the greatest interfering capacity and orange juice was the one with least interfering capacity. However PAHP was effective (reductions > 5 log CFU/mL) in all cases from 0.1 % PAHP and 10 min of exposure. No statistical differences were found between pathogenic and non pathogenic strains in the same group. Concerning the effect of UHPH treatment, in Listeria innocua ATCC 33090 both the inlet temperature and the food matrix influenced significantly (P < 0.05) the level of inactivation reached, which was higher in whole milk with inlet at 20 ºC. The UHPH treatment caused few or no sublethal injuries in L. innocua. During storage at 4.0 ºC after treatments, counts increased by approximately two logarithmic units from days 0 to 9 in whole milk, while in orange juice counts diminished by approximately 2.5 logarithmic units from days 0 to 18. The level of inactivation was similar for both strains of E. coli and no sublethal injuries were detected after treatments in milk as in juice of orange. Both the inlet temperature and the type of milk influenced significantly (P < 0.05) the degree of inactivation reached in both strains of E. coli, being higher at 20 ºC. The evolution of viable counts during storage at 4.0 ºC was similar in whole and skim milk but although ATCC 10536 strain counts did not show significant differences between the days 0 and 9 of storage, the strain CCUG 44857 showed a decreasing tendency of approximately 0.3 logarithmic units. In orange juice the strains of Escherichia coli showed a greater decreasing tendency and the strain CCUG 44857 was more resistant at low pH, maintaining high viable counts until 27th of storage. In Staphylococcus strains the inlet temperature, food matrix and the strain influenced significantly (P < 0.05) the lethality level, which was higher with 20 ºC of inlet temperature. We not observed sublethal injuries after treatments in any case. The evolution of viable counts showed for both strains a very strong decreasing tendency after 3 days of storage at 4 ºC for orange juice, although S. carnosus CECT 4491 showed a low decreasing tendency and great resistance when was inoculated in milk and pressurized at low temperatures. The PAHP was effective against all strains tested at concentrations above 0.1 % and exposure times over 10 minutes for all the organic matters studied. The UHPH treatments of whole milk, skim milk and orange juice at 300 + 30 MPa at inlet temperatures of 6 and 20 ºC were efficient to reduce the viable counts of Listeria innocua ATCC 33090, Escherichia coli ATCC 10536, Escherichia coli O157:H7 CCUG 44857, Staphylococcus aureus ATCC 13565 and Staphylococcus carnosus CECT 4491. The lethality increased with the inlet temperature, suggesting a clear effect of the temperature on the lethality values. The kind of matrix significantly influenced both the efficacy of the treatment and the growing capability during the subsequent storage period at low temperatures. Apparently UHPH treatment (300 + 30 MPa) did not cause significant sublethal injuries in any of the cases. UHPH technology may offer a promising alternative to the pasteurization of milk, juices and others liquid foods in combination with an increase of the inlet temperature of the sample before the process.