Vitrificación de ovocitos bovinos mediante la técnica Open Pulled Straw: estudio estructural de cromosomas, microtúbulos y microfilamentos y posterior desarrollo embrionario in vitro

Abstract

Este estudio fue diseñado para evaluar los efectos de la criopreservación de los ovocitos obtenidos de terneras prepúberes o de vacas adultas en la organización de los cromosomas, la morfología de los microtúbulos y la estructura del citoesqueleto, y el posterior desarrollo embrionario, para esto se realizaron tres grupos experimentales. En el primer grupo experimental los ovocitos una vez madurados in vitro (IVM), fueron divididos en 3 grupos según si eran: 1) sin ningún tratamiento (control); 2) expuesto a los agentes crioprotectores (CPAs); o 3) criopreservados por el método del vitrification de la open pulled straw (OPS). Después de descongelar los ovocitos una muestra de estos eran fijadas en paraformaldehido para posteriormente realizar técnicas de inmunofluorescencia específicas y examinadas debajo de un microscopio confocal. Los ovocitos restantes fueron fecundados y el porcentaje de división celular y desarrollo embrionario fueron registradas a las 48 h y 7 días post inseminación, respectivamente. Después de la vitrification o de la exposición a los CPAs, un porcentaje significativamente elevado de ovocitos mostraron cambios en la morfología del huso comparado al grupo control. La estructura de la placa metafásica de ovocitos de vaca madurados in vitro fue significativamente más resistente al proceso del vitrificación por OPS. La vitrificación de ovocitos procedentes de terneras o vacas adultas mostraron un aumento significativo en el porcentaje de ovocitos que presentaban banda de actina discontinua o ausencia de ésta comparado con los controles no tratados.<br/>Los ovocitos expuesto solamente a los CPAs mostraron un aspecto similar a los controles. Una distribución normal de los filamentos de actina fue observada en los ovocitos tanto de vaca como de ternera, independientemente del tratamiento. La división embrionaria y el porcentaje de blastocistos fueron significativamente menores en aquellos ovocitos vitrificados comparado con los ovocitos control. Los ovocitos obtenido de vacas adultas fueron más sensibles a la exposición a los CPAs, mientras que el proceso de vitrificación parecía tener efectos más perjudiciales en los ovocitos de ternera.<br/>En el segundo experimento la Roscovitina fue utilizado para mantener ovocitos de ternera en la etapa de vesícula germinal durante un período de 24 h. Los complejos cúmulus-ovocito fueron aspirados de ovarios de ternera y cultivados durante 24 h en TCM199 que contenía diversas concentraciones de Roscovitina (0, 12.5, 25, 50 y 100 &#61549;m). Después de este período de premaduración, un grupo de ovocitos fueron fijados para lacmoide o para inmunohistoquímica y el resto fueron cultivados durante 24 h más en las condiciones permisivas de maduración. Los ovocitos cultivados con Roscovitina, en todas las concentraciones probadas, fueron bloqueados en estadio de vesícula germinal. El efecto inhibitorio varió según la dosis, siendo las concentraciones más altas las más eficientes, produciendo el bloqueo en estadio de Vesícula Germinal en más del 60.0% de los ovocitos. Sin embargo, este efecto inhibitorio de la Roscovitina fue completamente reversible. El porcentaje de división y desarrollo embrionario de aquellos ovocitos premadurados con 50 &#61549;m de Roscovitina no fueron significativamente diferentes comparado a los ovocitos control. La morfología de la placa metafásica fue la típica del estadio de metafase II en el 75.8% de los ovocitos que alcanzaron el estadio de metafase II después del tratamiento previo con 50 &#61549;m de Roscovitina no difiriendo significativamente del grupo control. Una distribución normal de los filamentos de actina fue observada en un 97.0% y 98.2% de ovocitos expuestos a 50 &#61549;m Roscovitina comparada al control, respectivamente. Estos resultados demuestran la viabilidad de mantener los ovocitos de ternera en parada meiótica artificial sin comprometer su capacidad de desarrollo subsiguiente. <br/>En el último grupo experimental, el estudio fue diseñado para establecer los efectos del estadio de maduración nuclear de los ovocitos de ternera y de un tratamiento de premaduración con Roscovitina (ROS) sobre la resistencia a la criopreservación. Los ovocitos de ternera fueron vitrificados mediante OPS en estadio de vesícula germinal rota (GVBD) o en metafase II (MII). En otro experimento, los ovocitos en vesícula germinal rota fueron premadurados con 50 &#61549;M de ROS antes de la vitrificación. Después de la descongelación, los ovocitos en estadio de GVBD y aquellos premadurados con ROS y vitrificados en VGBD fueron madurados durante 18 h adicionales, mientras que aquellos vitrificados en estadio de MII fueron madurados durante 2 h más. Porcentajes significativamente más bajos de división embrionaria fueron obtenidos para el aquellos ovocitos vitrificados en estadio de GVBD y MII (9.9% y 12.6%, respectivamente) comparados con los ovocitos del grupo control (73.9%). Porcentajes de división embrionaria significativamente inferiores fueron obtenidos en aquellos ovocitos que fueron vitrificados en estadio de VGBD previa premaduración con ROS comparados con los ovocitos control o comparados con los ovocitos del grupo ROS-CONTROL. Independientemente del estadio de maduración nuclear en el que fueron vitrificados, no se obtuvo desarrollo embrionario. Un porcentaje significativamente inferior de ovocitos presentaban una placa metafásica normal después de ser expuestos a los crioprotectores y vitrificados (independientemente del estadio de maduración) comparado con los controles. Estos resultados indican que el protocolo del vitrification tiene un efecto negativo en la organización de la placa metafásica de los ovocitos de ternera vitrificados tanto en estadio de MI como de VGBD, lo cual afecta el posterior desarrollo embrionario. El tratamiento del premaduración con el ROS no tiene ningún efecto beneficioso en el resultado del vitrification por el método de OPS.

This study was designed to evaluate the effects of the cryopreservation of oocytes obtained from prepubertal calves or adult cows on chromosome organization, spindle morphology, cytoskeleton structures, and the ability of fertilized oocytes to develop to the blastocyst stage. Once in vitro matured (IVM), the oocytes were divided into 3 groups according to whether they were: 1) left untreated (control); 2) exposed to cryoprotectant agents (CPAs); or 3) cryopreserved by the open-pulled-straw (OPS) vitrification method. After thawing, oocyte samples were fixed, stained using specific fluorescent probes and examined under a confocal microscope. The remaining oocytes were fertilized, and cleavage and blastocyst rates recorded. After vitrification or CPA exposure, significantly higher proportions of oocytes showed changes in spindle morphology compared to the control group. The spindle structure of the adult cow IVM oocytes was significantly more resistant to the OPS vitrification process. Vitrification of oocytes from calves or adult cows led to significantly increased proportions of oocytes showing discontinuous or null actin staining of the cytoskeleton compared to non-treated controls. Oocytes only exposed to the cryoprotectants showed a similar appearance to controls. A normal distribution of actin microfilaments was observed in both calf and adult cow oocytes, irrespective of the treatment. Cleavage and blastocyst rates were significantly lower for vitrified versus non-treated oocytes. Oocytes obtained from adult cows were more sensitive to CPA exposure, while the vitrification procedure seemed to have more detrimental effects on the calf oocytes.<br/>In the second experiment Roscovitine, was used to maintain calf oocytes at the germinal vesicle stage for a 24-h culture period. Cumulus-oocyte complexes were aspirated from slaughterhouse calf ovaries and cultured for 24 h in TCM199 containing different levels of roscovitine (12.5, 25, 50 and 100 &#61549;M). After this culture period, the oocytes were either fixed immediately or cultured for a further 24 h in conditions permissive of maturation. After fixing a sample of these oocytes, the remaining oocytes were subsequently fertilized and cleavage and blastocyst rates were recorded. Oocytes cultured in the presence of roscovitine, at all the concentrations tested, were significantly blocked at the germinal vesicle stage. The inhibitory effect varied according to the dose, with 50 &#61549;M and 100 &#61549;M roscovitine being the most efficient concentrations, producing developmental arrest at the GV stage in over 60.0% of oocytes. However, this inhibitory effect of roscovitine was fully reversible since over 73% of the oocytes cultured for 24 h in the presence of 50 &#61549;M roscovitine reached the metaphase II stage after a further 24 h of culture in a permissive medium. Cleavage rates and blastocyst yields were not significantly different for oocytes cultured under 50 &#61549;M roscovitine inhibition compared to oocytes not subjected to prematuration culture (rates of 76.7% cleavage and 8.7% blastocysts for control oocytes compared to 69.8% and 6.3% respectively for oocytes pretreated with 50 &#61549;M roscovitine). The morphology of the meiotic spindle was typical of metaphase II in 75.8% and 82.1% of the oocytes reaching the metaphase II stage after pretreatment with 50 &#61549;M roscovitine compared to control, respectively. A normal distribution of actin filaments was observed in 97.0% and 98.2% of oocytes exposed to 50 &#61549;M roscovitine compared to control, respectively. These results demonstrate the feasibility of maintaining calf oocytes in artificial meiotic arrest without compromising their subsequent developmental competence<br/>The third experiment was designed to establish the effects of the meiotic stage of bovine oocytes and of a prematuration treatment with roscovitine (ROS) on their resistance to cryopreservation. Calf oocytes at the stages germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II (MII) were vitrified by the open pulled straw (OPS) method. In another experiment, GVBD oocytes were prematured with 50 &#61549;M ROS before vitrification. After thawing, oocytes in the GVBD and ROS groups underwent an additional 18 h of maturation, while those in the MII group were only subjected to a further 2 h of maturation. After this post-thaw maturation period. Significantly lower cleavage rates were obtained for the vitrified GVBD and MII oocytes (9.9% and 12.6%, respectively) compared to control oocytes (73.9%). Significantly worse results in terms of cleavage rates were obtained when GVBD calf oocytes were exposed to cryoprotectant (CPA) (13.1%) or vitrified (1.6%) after a prematuration treatment with ROS, when compared to untreated control oocytes (68.7%) or ROS-control oocytes (56.6%). None of the vitrification procedures yielded blastocysts, irrespective of the initial meiotic stage or previous prematuration treatment. Significantly lower proportions of oocytes showing a normal spindle configuration were observed after CPA exposure or vitrification of either GVBD or MII calf oocytes, compared to controls. When GVBD oocytes were vitrified, high percentages of dispersed chromosomes were observed, whereas a prematuration treatment before vitrification increased the proportions of decondensed chromosomes. These results indicate that the vitrification protocol has a deleterious effect on the meiotic spindle organization of calf oocytes cryopreserved at both the GVBD and MII stage, which impairs the capacity for further development of the embryos derived from these vitrified oocytes. Prematuration treatment with ROS has no beneficial effect on the outcome of vitrification by the OPS method.