Efecto del tratamiento de los espermatozoides sobre la fecundación in vitro en el caprino

Abstract

El principal objectiu del treball de recerca d'aquesta tesi fou l'estudi de l'efecte del tractament dels espermatozoides caprins frescs sobre diferents paràmetres seminals i la seva relació amb els resultats de fecundació in vitro (FIV) d'oòcits de cabres prepúbers madurats in vitro.<br/>Per tal d'assolir aquest objectiu, es varen fixar els següents objectius concrets: 1) Estudiar l'efecte de diferents sistemes de rentat i selecció dels espermatozoides (swim-up, gradient discontinu de Percoll, rentat per centrifugació i centrifugació mitjançant una solució de Ficoll) sobre els resultats de FIV, 2) Estudiar l'efecte de la inducció in vitro de la capacitació espermàtica mitjançant diferents concentracions (5, 50 i 100 &#956;g/mL) i temps de preincubació (1, 15, 30, 45 i 60 min) amb heparina, 3) Determinar la concentració òptima d'espermatozoides en el medi de fecundació, 4) Valorar la incidència de reacció acrosòmica espontània i la seva relació amb la taxa de penetració dels oòcits de cabra i la seva divisió embrionària i 5) Analitzar l'evolució de la motilitat, viabilitat i integritat de l'acrosoma dels espermatozoides durant las diferents fases de la FIV i la seva relació amb els resultats de fecundació. <br/>Els anàlisis seminals realitzats en aquest treball van consistir en l'anàlisi subjectiu de la motilitat individual dels espermatozoides, la viabilitat d'aquests mitjançant la tinció d'eosina-nigrosina, la incidència de reacció acrosòmica verdadera mitjançant la Triple Tinció i la integritat de l'acrosoma mitjançant l'ús de la lectina Pisum Sativum marcada amb fluoresceïna durant tot el procés de la FIV.<br/>Els resultats obtinguts permeteren concloure que en les nostres condicions: 1) No és necessari la realització de tècniques de rentat i selecció dels espermatozoides frescs procedents de bocs de provada fertilitat per a l'obtenció d'embrions a partir de oòcits madurats i fecundats in vitro. 2) La utilització d'heparina per a induir la capacitació espermàtica incrementa significativament els resultats de FIV, obtenint els millors resultats de divisió embrionària amb concentracions altes d'heparina (50 i 100 µg/mL) en el medi de pre-incubació dels espermatozoides, no observant diferències significatives en els resultats de FIV antre els diferents temps de pre-incubació. 3) Una concentració de 4x106 de espermatozoides viables/mL a les gotes de FIV proporciona els millors resultats de divisió embrionaria. 4) La incidència de la reacció acrosòmica espontània no està relacionada con la taxa de penetració, encara que es veu afavorida per la presencia dels complexes cumulus-oòcit, observant un increment en el nombre d'espermatozoides vius que pateixen dita reacció entre las 8-12 hores de co-cultiu de les gàmetes i 5) Els paràmetres seminals avaluats (motilitat, viabilitat i integritat de l'acrosoma) durant el procés de preparació dels espermatozoides frescs de boc no influeixen sobre els resultats de FIV de oòcits de cabres prepúbers madurats in vitro.

El principal objetivo del trabajo de investigación de esta tesis fue el estudio del efecto del tratamiento de los espermatozoides caprinos sobre distintos parámetros seminales y su relación con los resultados de fecundación in vitro (FIV) de ovocitos de cabras prepúberes madurados in vitro.<br/>Para ello se fijaron los siguientes objetivos concretos: 1) Estudiar el efecto de diferentes sistemas de lavado y selección de los espermatozoides frescos (swim-up, gradiente discontinuo de Percoll, lavado mediante centrifugación y centrifugación mediante una solución de Ficoll) sobre los resultados de FIV, 2) Estudiar el efecto de la inducción in vitro de la capacitación espermática mediante distintas concentraciones (5, 50 y 100 &#956;g/mL) y tiempos de preincubación (1, 15, 30, 45 y 60 min) con heparina, 3) Determinar la concentración óptima de espermatozoides en el medio de fecundación, 4) Valorar la incidencia de reacción acrosómica espontánea y su relación con la tasa de penetración de los ovocitos de cabra y división embrionaria y 5) Analizar la evolución de la motilidad, viabilidad e integridad del acrosoma de los espermatozoides durante las distintas fases de la FIV y su relación con los resultados de fecundación. <br/>Los análisis seminales realizados en este trabajo consistieron en el análisis subjetivo de la motilidad individual de los espermatozoides, la viabilidad de éstos mediante la tinción de eosina-nigrosina, la incidencia de reacción acrosómica verdadera mediante la Triple Tinción y la integridad del acrosoma mediante el uso de la lectina Pisum Sativum marcada con fluoresceína a lo largo de todo el proceso de la FIV.<br/>Los resultados obtenidos nos permitieron concluir que en nuestras condiciones: 1) No es necesario la realización de técnicas de lavado y selección de los espermatozoides frescos procedentes de machos cabríos de probada fertilidad para la obtención de embriones a partir de ovocitos madurados y fecundados in vitro. 2) La utilización de heparina para inducir la capacitación espermática incrementa significativamente los resultados de FIV, obteniéndose los mejores resultados de división embrionaria con concentraciones altas de heparina (50 y 100 µg/mL) en el medio de pre-incubación de los espermatozoides, sin observarse diferencias significativas en los resultados de FIV al utilizar diferentes tiempos de pre-incubación. 3) Una concentración de 4x106 de espermatozoides viables/mL en las gotas de FIV proporciona los mejores resultados de división embrionaria. 4) La incidencia de la reacción acrosómica espontánea no está relacionada con la tasa de penetración, aunque se ve favorecida por la presencia de los complejos cúmulos-ovocitos, observándose un incremento en el número de espermatozoides vivos que sufren dicha reacción entre las 8-12 horas del co-cultivo de los gametos y 5) Los parámetros seminales evaluados (motilidad, viabilidad e integridad del acrosoma) a lo largo del proceso de preparación de los espermatozoides caprinos frescos no influyen sobre los resultados de FIV de ovocitos de cabras prepúberes madurados in vitro.

The main aim of the research work of this thesis was to study the effect of the treatment of fresh caprine spermatozoa on different sperm parameters and its potential relationship to the in vitro fertilization (IVF) of in vitro matured (IVM) prepubertal goat oocytes. <br/>Therefore the following specific aims were fixed: 1) To study the effect of different methods of washing and selection of spermatozoa (swim-up, centrifugation in Percoll gradients, centrifugation and centrifugation in Ficoll medium) on the IVF of IVM oocytes from prepubertal goats. 2) To study the effect of the induction of sperm capacitation after exposure of spermatozoa to different concentrations (5, 50 and 100 &#956;g/mL) and different exposure intervals (1, 15, 30, 45 and 60 min) of heparin. 3) To determine the optimal sperm concentration on the fertilization medium, 4) To assess the spontaneous acrosome reaction and its relationship with IVF results and 5) To analyze the sperm motility, viability and acrosome integrity evolution during the different phases of the IVF and its relation with the results of penetration and embryo cleveage rate.<br/>The different sperm parameters analysis were the subjective assessment of the percentage of sperm progressive motility, the viability of the spermatozoa evaluated by eosine-nigrosine stain, the incidence of spontaneous acrosome reaction using the simplified triple stain technique or TST and the evaluation of the acrosome status using Pisum Sativum lectin labelled with FITC along the IVF process.<br/>The obtained results allowed to us to conclude that in ours conditions: 1) washing and selection methods of fresh spermatozoa from male of tested fertility are not necessary for obtaining embryos from in vitro matured and fertilized oocytes. 2) Using heparin to induce the in vitro sperm capacitation increase significantly the IVF results, getting the best percentages of cleavage rate with high concentrations of heparin (50 and 100 µg/mL) in the sperm pre-incubation medium, not observing significant differences on IVF percentages among the different exposure intervals of preincubation. 3) A concentration of 4x106 of viable sperm/mL in the IVF microdrop gives the best cleavage rate. 4) The incidence of spontaneous acrosome reaction is not related to the penetration rate, although is facilitated by the presence of cumulus-oocyte complex, observing an increase on the live acrosome reacted sperm between 8-12 hours post-insemination and 5) the evaluated sperm parameters (motility, viability and acrosome integrity) along the sperm treatment don't influence on IVF of goat prepubertal in vitro matured oocytes.