OPA1 deficiency drives muscle inflammation = La deficiència d'OPA1 resulta en inflamació muscular

Abstract

Opa1 is a mitochondrial dynamics protein responsible for the fusion of the inner mitochondrial membrane, the maintenance of cristae morphology, and involved in mitochondrial DNA stability. In this study we have explored the origin of the effects of Opa1 deficiency in skeletal muscle, as well as the cellular mechanisms that give rise to the primary responses derived from its deficiency in the muscle context. Chronic treatment with an anti-inflammatory compound rescued the growth defects that suffer mice defective of Opa1 in skeletal muscle, observed in previous studies. These results indicate that inflammation is the primary cause of this growth impairment. The analysis of the origin of this inflammation allows us to describe that it is a NF- κB activation-mediated, local, primary and autonomous process of the muscle cell. At the intracellular level, the data show that the deficiency of Opa1 generates mitochondrial network fragmentation and disarrangement, and a reduction in the oxidative capacity of the electron transport chain of the mitochondria. These observations were made both in muscle cells and in skeletal muscle, which correlates with a dysfunctionality of the mitochondrial fusion as well as of the morphogenesis of the cristae of the organelle. Likewise, the loss of Opa1 function in muscle cells results in a 50% reduction in the mitochondrial DNA content, accompanied by a comparable reduction on TFAM protein levels. Confocal microscopy analysis show a reduction in the number of mitochondrial DNA nucleoids per cell, as well as an enhancement of the relative area of each nucleoids, which has been described as mitochondrial DNA stress. Given the features of mitochondrial DNA, owing to the past of mitochondria as free living bacteria, it has a powerful immunogenic capacity as a damage associated molecular pattern. From the two main pathways with potential to detect misplaced mitochondrial DNA and induce NF-κB activation, we discarded cGAS activation due to the fact that mitochondrial DNA is not detected in the cytosol and that cGAS deficiency is unable to normalize the expression of NF-κB target genes. Given the absence of the molecule in the cytosolic fraction, we analyzed the functionality of mitophagy. Although in Opa1 loss-of-function cells mitophagy initiates normally, the completion of the mitophagic process is impaired, probably resulting in an accumulation of undegraded mitochondrial components, which has been reported that can produce an intracellular inflammatory response. Studies of the location of mitochondrial DNA indicate that all nucleoids are found in mitochondria-containing compartments. In addition, more than half are located in

late endosomes. Approximately the same portion is localized in compartments also positive for TLR9. We assessed the importance of this two key components, mitochondrial DNA and TLR9, in the development of the inflammatory response by ablating one or the other and assessing the normalization of NF-κB target gene expression. Indeed, reduction of mitochondrial DNA copy number to a residual 5% rescued the expression pro-inflammatory genes. Moreover, treatment with TLR9 antagonist also restored NF-κB target genes expression and extracellular concentration of IL-6. In parallel to these data, TLR9 depletion can as well normalize inflammatory genes expression. The data compiled in this study indicate that Opa1 deficiency results in mitochondrial dysfunction together with mitochondrial DNA stress. The mitophagy machinery of the cell is able to identify this damage and restrain the damaged mitochondria into mito-autophagosome that, by a mechanism that still needs further investigation, is re-routed to the endosomal pathway. In late endosomes mtDNA can interact with TLR9 which in turn results in activation of NF-κB pro-inflammatory pathway resulting, eventually, in the secretion of cytokines that may potentially cause the growth defects observed in the skeletal muscle specific Opa1 deficient mouse model.

La proteïna Opa1 és una GTPasa de dinàmica mitocondrial responsable de la fusió de la membrana mitocondrial interna, del manteniment de la morfologia de les crestes mitocondrials, i relacionada amb l’estabilitat de l’ADN mitocondrial. En aquest estudi explorem l’origen dels efectes de la deficiència d’Opa1 en múscul esquelètic, així com els mecanismes cel·lulars que donen lloc a les respostes primàries derivades de la deficiència en el context muscular. Les dades obtingudes durant el transcurs d’aquesta tesi doctoral identifiquen la inflamació com la causa dels defectes de creixements, observats en estudis anteriors, que pateixen els animals deficients d’Opa1 en múscul esquelètic. L’anàlisi de la procedència d’aquesta inflamació permet descriure que es tracta d’un procés local, primari i autònom de la cèl·lula muscular. A nivell intracel·lular, les dades mostres que la deficiència d’Opa1 genera una desestructuració de la xarxa mitocondrial, i una reducció en la capacitat oxidativa de la cadena de transport d’electrons del mitocondri, tant en cèl·lules com en múscul esquelètic, el que es correlaciona amb una disfuncionalitat tant de la fusió mitocondrial com de l’estructuració de les crestes de l’orgànul. Així mateix, la pèrdua de funció d’Opa1 en cèl·lules musculars comporta una reducció del 50% en el contingut d’ADN mitocondrial, com també presència d’estrès de l’ADN mitocondrial. L’anàlisi de la funcionalitat de la mitofàgia en aquestes condicions indica una correcta iniciació però una manca de finalització, resultant en una acumulació de material mitocondrial no degradat, el que ha estat reportat que pot produir una resposta inflamatòria intracel·lular. Estudis de la localització del ADN mitocondrial indiquen la seva absència en el citosol, contràriament la totalitat de nucleoides es troben en compartiments mitocondrials. A més, més de la meitat es localitzen en endosomes tardans on també colocalitzen amb el receptor TLR9. L’absència de ADN mitocondrial o de TLR9 són suficients per cancel·lar la resposta inflamatòria, pel que podem afirmar que és el TLR9 el que detecta l’ADN mitocondrial i engega la resposta inflamatòria que donarà lloc a la producció de citocines i potencialment als defectes observats en el model animal.