Los bacteriófagos como elementos de transmisión genética horizontal de resistencias a antibióticos y toxinas Stx

Abstract

Tanto los genes de resistencia a antibióticos (ARGs) como algunos genes de virulencia son movilizados entre las poblaciones bacterianas por elementos genéticos móviles (MGE). La transferencia horizontal de genes (HGT) está mediada por MGE tales como plásmidos, islas de patogenicidad, transposones y bacteriófagos. Esta tesis analiza los mecanismos de transferencia de genes mediada por partículas fágicas movilizadoras de genes de resistencia a antibióticos y fagos Stx como modelo de transducción de genes de virulencia con fagos auto-propagables. Algunos géneros bacterianos pueden producir elementos similares a los fagos usando información codificada en su propio genoma. Esta “partículas fágicas” llamadas “agentes de transferencia génica” (GTAs), tienen una cápside de tipo bacteriófago y aunque hasta el momento se han descrito en pocos grupos, es razonable pensar que estén presentes en otros grupos bacterianos. Una diferencia importante entre la movilización génica por parte de los GTAs y la transducción generalizada radica en que no es necesaria la infección previa de un fago, y además, los GTAs en lugar de transportar ADN que codifica su propia replicación, sólo contienen fragmentos del genoma bacteriano. En el capítulo llamado “Genes de resistencia a antibiótico en el ADN de bacteriófagos en muestras fecales” se analizaron muestras fecales de 80 individuos que no presentaban ninguna patología intestinal. Se comparó el ADN total con el ADN viral la abundancia de seis ARGs relevantes. Los resultados mostraron que los genes de resistencia β-lactámicos, blaCTX-M-1 y sobretodo blaTEM, y el gen de resistencia a quinolonas qnrA, fueron los más abundantes, tanto en el ADN total como el viral. El gen mecA, pese a ser considerado de gran relevancia al conferir resistencia a la meticilina a Staphylococcus spp, no fue nada frecuente. Quizás porque Staphylococcus spp. no se encuentra habitualmente en el tracto intestinal. Lo que realmente sorprendió fue la alta prevalencia de ARGs en el ADN fágico, demostrando que las partículas fágicas (quizás GTAs) pueden desempeñar un papel importante en la diseminación de resistencias. En cuanto a la HGT por medio de bacteriófagos (auto-propagadores), hemos estudiado el gen de virulencia stx y su fago portador Stx. En el capítulo “Los bacteriófagos libres que codifican para la toxina Shiga 1 son menos frecuentes que los bacteriófagos de la toxina Shiga 2 en ambientes extraintestinales” nos propusimos estudiar los fagos Stx1, mucho menos estudiados que los fagos Stx2. Para ello, diseñamos una nueva qPCR específica para todas las variantes de stx1. Posteriormente se analizaron 357 muestras ambientales, en las que solo el 7,6% fueron positivas, contrastando con la presencia de fagos Stx2 en el 68,4 % en las mismas. En el trabajo llamado “Contribución de la tierra de cultivo a la propagación de fagos de la toxina Shiga y la emergencia de nuevas cepas productoras de toxina Shiga” nos centramos en estudiar la presencia, abundancia, y capacidad de propagación de los fagos Stx en muestras de vegetales y tierra de cultivo. Así como la persistencia, y capacidad de generar nuevas cepas transductantes stx2+. Los resultados de propagación, unidos a la persistencia de fagos Stx2, y a los transductantes generados en todos los vegetales y tierra, confirma que en estos alimentos, consumidos crudos habitualmente, existe un riesgo de que ocurra la transducción del gen stx. Esto causaría la aparición de nuevas cepas productoras de la toxina Shiga. Por último, el trabajo llamado “Mejora de la detección de Escherichia coli productora de toxina Shiga por métodos moleculares mediante la reducción de la interferencia de los bacteriófagos Stx”, presentamos la posibilidad de que la presencia en las muestras de fagos Stx libres pueden generar un positivo por PCR o NGS. Esto generaría falsos positivos en la detección de bacterias STEC tanto en hospitales como en la industria alimentaria. Nuestro estudio confirma que los métodos rutinarios utilizados para la extracción de ADN bacteriano en matrices complejas también extraen ADN fágico. El método propuesto, basado en un sencillo paso previo de filtración y lavado de la muestra, elimina considerablemente los niveles de bacteriófagos Stx, desde 2,6 hasta 3,35 logaritmos en función del tipo de muestra, sin alterar en absoluto los niveles de recuperación bacteriana.

The antibiotic resistance genes (ARGs) and some virulence genes are mobilized between the bacterial populations by mobile genetic elements (MGE). Horizontal gene transfer (HGT) is mediated by MGE such as plasmids, pathogenicity islands, transposons and bacteriophages. This thesis analyzes the mechanisms of gene transfer mediated by phage particles mobilizing genes of resistance to antibiotics and Stx phages as a model of transduction of virulence genes with self-propagating phages. In the chapter called "Antibiotic resistance genes in the DNA of bacteriophages in fecal samples", fecal samples from 80 individuals who did not present any intestinal pathology were analyzed. The total DNA was compared with the viral DNA for the abundance of six relevant ARGs. What really surprised was the high prevalence of ARGs in the phage DNA, demonstrating that phage particles (perhaps GTAs) can play an important role in the dissemination of resistances. In the chapter "The free bacteriophages that code for the Shiga toxin 1 are less frequent than the bacteriophages of the Shiga toxin 2 in extraintestinal environments", we set out to study the Stx1 phages, much less studied than the Stx2 phages. To do this, we designed a new qPCR specific to all the stx1 variants. Subsequently, 357 environmental samples were analyzed, in which only 7.6% were positive, contrasting with the presence of Stx2 phage in 68.4% of them. In the work called "Contribution of the cultivation soil to the propagation of phages of Shiga toxin and the emergence of new strains producing Shiga toxin" we focused on studying the presence, abundance, and capacity of propagation of Stx phages in samples of vegetables and farmland. As well as the persistence, and ability to generate new stx2+ transducing strains. The results confirm that in these foods, consumed raw usually, there is a risk of transduction of the stx gene. Finally, the work called "Improvement of the detection of Escherichia coli producing Shiga toxin by molecular methods by reducing the interference of Stx bacteriophages", we present the possibility that the presence in samples of free Stx phages can generate false positive in the detection of STEC bacteria both in hospitals and in the food industry. The proposed method eliminates Stx bacteriophages, from 2.6 to 3.35 logarithms depending on the type of sample, without altering the levels of bacterial recovery at all.