Heterómeros de receptores CB1, CB2 y GPR55 y su implicación en enfermedades neurodegenerativas y alcoholismo

Abstract

Los receptores de cannabinoides, CB1R y CB2R, que forman parte del sistema endocannabinoide, pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a proteína G (GPCR). El sistema endocannabinoide se encuentra estrechamente relacionado con enfermedades neurodegenerativas que cursan con un proceso de neuroinflamación, como el Parkinson y el Alzheimer. En este proyecto de tesis se ha investigado el papel de los receptores CB1 y CB2 y del heterómero CB1R/CB2R en el contexto de la neuroinflamación. Para ello, se emplearon células N9 inmortalizadas de microglía que expresan los receptores CB1 y CB2, tratadas con LPS e IFN-γ para simular la neuroinflamación, así como tejido y cultivos primarios de animales modelo de la enfermedad de Alzheimer y de la enfermedad de Parkinson. Mediante el uso de técnicas de transferencia de energía y de microscopía confocal se demostró que la formación de heterómeros entre CB1R y CB2R se potencia en condiciones de neuroinflamación. También se constató un aumento de la expresión del receptor CB2 en microglía activada, que afectó a la formación de heterómeros CB1R/CB2R. El análisis de la señalización cannabinoide en células N9 y en los modelos animales demostró que la señalización cannabinoide en microglía activada contrasta con la observada en las células en reposo. Mientras que en reposo se observa un fenómeno de cross-talk negativo entre los receptores CB1 y CB2, en células activadas se observa un cross-talk positivo. Estos resultados convierten al heterómero CB1R/CB2R en una interesante diana terapéutica en procesos neuropatológicos que cursan con neuroinflamación. El sistema endocannabinoide también está implicado en procesos adictivos como el alcoholismo. En adicción alcohólica, una de las estructuras cerebrales más afectadas es el hipocampo. En el segundo apartado de esta tesis doctoral se analizó el efecto del etanol en la señalización de los receptores CB2 y GPR55 (receptor relacionado con el sistema endocannabinoide) y del heterómero CB2R/GPR55, tanto en células HEK-293T transfectadas como en neuronas de hipocampo de rata. Pudo comprobarse que el etanol no altera la heteromerización de los receptores CB2 y GPR55 en células transfectadas. El análisis de la funcionalidad mostró que el etanol no afecta a la señalización por la vía del cAMP del receptor CB2 individual ni del heterómero CB2R/GPR55, ni en células transfectadas ni en cultivos primarios. Este resultado contrasta con la fuerte inhibición en la fosforilación de ERK1/2 observada en ambos modelos celulares, que afectó al receptor CB2R y al heterómero CB2R/GPR55. El análisis de la señalización por calcio del receptor GPR55 en células transfectadas mostró que el etanol potencia la señalización vía calcio de este receptor. Finalmente, mediante técnicas de microscopía confocal, pudo comprobarse que en la corteza frontal de pacientes alcohólicos la heteromerización de los receptores CB2 y GPR55 está potenciada, con un incremento en el número de heterómeros observados con respecto a los individuos sanos. Estos resultados, junto con las evidencias previas de la implicación del sistema endocannabinoide en el alcoholismo, convierten a los receptores CB2 y GPR55 y al heterómero CB2/GPR55 en una interesante diana terapéutica.

CB1 and CB2 receptors are part of the mammalian endocannabinoid system, which is involved in neurologic alterations involving neuroinflammation. Considering these precedents, in this thesis project the main objectives were to demonstrate the implication of cannabinoid receptor heteromers in the regulation of neuroinflammatory processes in activated microglia, in the context of neurodegenerative diseases such as Parkinson’s or Alzheimer’s diseases. Using N9 cells and animal models of Parkinson’s and Alzheimer’s diseases, along with Bioluminescence resonance energy transfer and microscopy techniques, we could demonstrate that the action of cannabinoids on CB1R/CB2R heteromers are potentiated in activated microglia. Using advanced techniques for the study of cell signaling, we were able to prove relevant changes in the signaling of cannabinoid receptors. Whereas in resting cells we could observe negative cross-talk between CB1 and CB2 receptors, in activated microglia this phenomenon changed to a positive cross-talk. Taking in mind these results, and with further investigation, the endocannabinoid system is a promising therapeutic target in neurodegenerative and neuroinflammatory diseases. The endocannabinoid system is also implicated in some addiction processes such as alcoholism. It’s also important to note that in alcoholism the hippocampus is altered. In the second part of this Thesis, we aimed to study the effect of ethanol in the signaling of CB2R, GPR55 (which is related with the endocannabinoid system) and the heteromer CB2R/GPR55. Using transfected HEK-293T cells and primary cell cultures from rat hippocampus, along with Bioluminescence resonance energy transfer and microscopy techniques, we could determine that ethanol did not affect heteromerization. However, cell signaling analysis determined that ethanol inhibits ERK1/2 phosphorylation induced by CB2R and CB2R/GPR55 activation. Calcium signaling analysis of GPR55 resulted in a potentiation of the signal; presumably because of ethanol. We could also study CB2R and GPR55 heteromerization in prefrontal cortex of human alcoholic patients, using proximity ligation assays. Using this approach, we could determine that, compared with age-matched controls, there is an increase in the expression of heteromers. With these interesting results, it is possible to point cannabinoid receptors as therapeutic targets in alcoholism.