Tuning the biological performance of calcium phosphates through microstructural and chemical modifications

Abstract

Bone is the most transplanted tissue after blood. As pointed out by the World Health Organization, musculoskeletal diseases can potentially rise as the fourth largest cause of disability within the next years. Unfortunately, despite the natural ability of bone to self-heal it cannot bridge large bone defects without the help of a material. Still today the gold standard to restore bone function remains the use of natural bone grafts. However, they have several limitations that need to be overcome to accommodate the high demands of a global ageing population. Calcium phosphate (CaP) bone grafts have been known since the 1970s and stand as excellent synthetic candidates due to their composition, similar to the mineral phase of bone which consists of approximately 70 wt% of hydroxyapatite (HA). CaPs, and in particular HA, possess outstanding intrinsic properties such as biocompatibility, bioactivity and the ability to support bone growth. However, HA is too stable and once implanted it hardly degrades. Ideal synthetic bone grafts should integrate in the bone remodelling cycle, balancing implant resorption with its progressive replacement by new bone. This can be achieved either by modulating the material¿s physicochemical properties, or by combining the substrate with biological molecules capable of adequately orchestrating the various cells involved in the bone healing process. The present thesis seeks to explore, on the one hand, the feasibility of modulating the physicochemical properties of CaPs towards improving its degradation behavior, and, on the other hand, to investigate the potential CaP functionalization with heparin as a strategy to improve their biological performance at the various stages of bone healing: during the initial phase of inflammation, and during the stages of bone resorption and bone growth. The first part of the present thesis deals with the in vitro degradation of CaPs in a solution mimicking the osteoclastic environment, focusing specifically on the effect of some properties like porosity, specific surface area, microstructure and composition. The interrelation of all these parameters sometimes masks the relative importance of textural over compositional features, making difficult the prediction of their degradation behavior. Additionally, part of the work explores different strategies to incorporate carbonate ions in the crystal structure of HA as a route to obtain materials that more closely mimic natural bone. To further mimic the biological environment of bone, the second part of the thesis is focused on grafting heparin, a highly sulfated glycosaminoglycan present in the bone extracellular matrix, to CaPs. The affinity of heparin for growth factors (GF) makes this molecule an excellent candidate to capture endogenous GF bringing many benefits in the regulation of cell behavior. It is hypothesized that heparin, given its anti-inflammatory role, together with the known involvement in osteoblasts differentiation (bone forming cells) and osteoclastogenesis (bone resorbing cells formation) could enhance the biological performance of synthetic bone grafts. To this aim, CaPs were heparinized and their biological performance was assessed using human immune system cells, bone forming cells and bone resorbing cells, in an attempt to elucidate the synergies of both immune cells and cells of the skeletal system.

L'os és el teixit més trasplantats desprès de la sang. L'organització Mundial de la Salut ha posat de relleu l'increment de les malalties musculoesquelètiques, les quals esdevindran la quarta causa mundial de discapacitat en el següents anys. Malgrat la capacitat natural de l'ós per autoregenerar-se, els defectes ossis de grans dimensions necessiten l'ajuda de materials per restaurar-se completament. Actualment, l'ús d'empelts naturals és l'alternativa més emprada clínicament. Tot i això, els autoempelts comporten certes limitacions que requereixen ser adreçades per tal de fer front a les elevades demandes d'una població mundial amb un grau d'envelliment creixent. Els empelts basats en fosfats càlcics (CaPs) són coneguts des de la dècada del 1970 i són uns excel·lents candidats per a la regeneració òssia donada la seva composició, similar a la fase mineral de l'os, que consisteix en aproximadament un 70% d'hidroxiapatita (HA). Els CaPs, en particular l'HA, posseeixen unes propietats intrínseques excepcionals com ara la biocompatibilitat, bioactivitat o la capacitat de suportar el creixement de nou os. Malgrat la seva semblança amb l'os, l'HA és massa estable químicament, i un cop implantada es degrada molt lentament. L'empelt ossi sintètic idealment s'hauria d'integrar en el cicle de remodelació òssia, el que requereix d'un balanç entre la seva reabsorció i la progressiva substitució per os nou. Aquesta capacitat es pot modular mitjançant propietats inherents del material o per mitjà de la combinació de substrats amb molècules capaces d'orquestrar adequadament les respostes de les diverses cèl·lules implicades en la restauració o regeneració òssia. La present tesis cerca explorar, per una banda, la possibilitat de modular les propietats físico-químiques dels CaPs per tal de millorar la seva degradació, així com investigar el potencial de funcionalitzar els CaPs amb heparina, amb la finalitat de millorar les interaccions biològiques a les diferents etapes de la restauració òssia, tant durant la primera etapa inflamatòria, com durant la resorció i el creixement d'os nou. Concretament, la primera part de la present tesi explora la manera en què la modificació de propietats com la porositat, la superfície específica, la microestructura o la composició dels CaPs pot ser emprada per regular la degradació d'aquests materials en una solució acídica similar a l'emprada pels osteoclasts durant la resorció òssia. La interrelació de totes aquestes propietats emmascara de vegades la importància relativa de les propietats texturals, molt lligades a les composicionals, dificultant la predicció dels nivells de degradació dels materials depenent de cada propietat. Per tal de mimetitzar encara més la composició de l'os, s'estudiarà també diferents estratègies per incorporar ions carbonat en l'estructura cristal·lina de l'HA. El segon bloc de la tesi explora la funcionalització dels CaPs amb heparina, un tipus de glicosaminoglicà altament sulfonat present en la matriu extracel·lular de l'os. L'afinitat de l'heparina per captar factors de creixement fan d'aquesta molècula un candidat excel·lent per capturar factors de creixement endògens capaços de regular la resposta cel·lular. Així doncs, partint de les propietats anti-inflamatòries de l'heparina, i de la seva implicació en els processos d'osteogènesi i osteoclastogènesi s'ha formulat la hipòtesi de que aquesta biomolècula podria contribuir a millorar les prestacions dels empelts ossis sintètics. Amb aquest objectiu, s'ha posat a punt un procés d'heparinització de CaPs i s'ha avaluat el seu efecte sobre la resposta de cèl·lules humanes del sistema immune, cèl·lules osteogèniques i osteoclàstiques, per tal d'escatir les possibles sinèrgies de tots dos sistemes, l'immune i l'ossi en la regeneració.