Desenvolupament d’una formulació i forma farmacèutica estable per vectors adenovirals

Abstract

Els vectors adenovirals estan lluny de ser establerts com a pràctica habitual en teràpia gènica degut a la dificultat de preservar la seva activitat en unes condicions òptimes pel transport i l’administració. Actualment, l’estabilització dels adenovirus a llarg termini requereix de la presència de glicerol a una temperatura de -80ºC. Aquesta temperatura d’ultra-congelació genera importants inconvenients a nivell d’emmagatzematge, transport i pràctica clínica. I per altra banda, la presència de glicerol requereix d’una extensa dilució abans de l’administració per reduir els efectes tòxics. Així doncs, la millora de la termoestabilitat ha estat reconeguda com una diana imprescindible per millorar l’impacte dels vector virals en la salut. L’objectiu d’aquest estudi va ser la identificació d’una combinació adequada d’excipients que permetés conservar l’Adenovirus tipus 5 a temperatures superiors mantenint la infectivitat a nivells acceptables. Alhora s’havia de dissenyar un cicle de liofilització que permetés una estabilitat millorada que limités les pèrdues de funcionalitat amb un comportament més controlable i reproduïble. Aquest objectiu requeria d’una aproximació global que comencés analitzant els factors que intervenen en l’estabilitat viral abans i després de la liofilització, i els mecanismes responsables de la inactivació durant l’emmagatzematge. Entre els factors que afecten l’estabilitat destaquen la concentració vírica, el pH, l’agregació i la humitat. És crucial controlar els darrers paràmetres durant el procés mitjançant la tècnica de Dynamic Light Scattering (DLS) i coulometric Karl Fischer titration, així com verificar el títol físic i funcional a les diferents etapes del procés per garantir un bon disseny. Es va desenvolupar un set de formulacions per avaluar la seva efectivitat protectora en solució a 5ºC, en liofilització i durant l’emmagatzematge. S’ha identificat una formulació estable un mínim de 8 h a temperatura ambient adient per l’escalat industrial. Els cicle de liofilització dissenyat i la formulació seleccionada eviten les pèrdues d’activitat durant la liofilització a la mida de lot establerta. La funcionalitat es manté fins al punt d’anàlisi de l’estudi d’estabilitat de 3 mesos a 5ºC i -20ºC. La formulació candidata està essent sotmesa a un estudi d’estabilitat de 2 anys a -20ºC, 5ºC i 25ºC.

Adenoviral vectors are far from being commonly established in clinic use because of the complexity to preserve their activity at optimal conditions of transport and administration. Currently, the stabilization of adenovirus for long-term storage requires the presence of glycerol at -80ºC. This ultra-low temperature creates significant inconvenient for storage, transport and practical clinic use. In the other hand, the presence of glycerol requires an extensive dilution before administration to reduce toxic effects. So, enhancing the thermostability has long been recognized as the target for improving the impact of viral vectors on world health. The goal of this study was the identification of a suitable combination of excipients which allows the storage of Adenovirus type 5 vector at higher temperatures and the maintenance of infectivity at an acceptable level. At the same time, it was necessary a design of a lyophilization process that enhanced stability by limiting the loss of infectivity with a more controllable and reproducible behavior. This goal requires a global approach that starts by analyzing the factors that influence stability of viral preparations prior to and during freeze-drying, and the major mechanisms responsible for inactivation during storage. Among the factors that affect stability highlight virus concentration, pH, aggregation and residual water. It is crucial to control the previous factors during the process by Dynamic Light Scattering (DLS) and coulometric Karl Fischer titration, as well as verify the physical and functional titer at different points of the process to assure well-design. A battery of formulations has been developed to test its effectiveness in terms of liquid stability at 4ºC, freeze-dry impact and stability of lyophilized powder during storage. A formulation stable until 8 hours in liquid at room temperature has been identified what it is suitable for industrial scale. The designed lyophilization process with the selected formulation avoid the loss of activity during lyophilization at the stablished lot size. The titer is maintained at the analytical point of stability study of 3 months at 5°C and -20°C. This formulation is being submitted to a 2-years stability program at -20°C, 5°C and 25°C.