Enhancement of virus-like particle production in HEK293 cell cultures

Abstract

Les virus-like particles (VLP) tenen un gran potencial com a candidats pel desenvolupament de vacunes. En aquest treball, s’han aplicat diverses estratègies per la millora de la producció de VLPs (basades en la poliproteïna Gag del VIH-1) en HEK293 mitjançant la transfecció transitòria i l’expressió estable. Aquest candidat té aplicacions potencials en el desenvolupament d’una vacuna terapèutica contra la SIDA. Tres capítols del treball descriuen estratègies basades en la transfecció transitòria, mentre que l’últim capítol consisteix en la generació d’una línea HEK293 estable per la producció de VLPs de VIH-1. En el primer capítol, es va dur a terme la combinació de l’estratègia extended gene expression (EGE) amb la complementació del medi amb additius químics. L’EGE (basada en la repetició de diversos recanvis de medi i retransfeccions) ha reportat una millora en la producció de VLPs de 12 cops mentre que la complementació química del medi amb potenciadors de l’expressió gènica comporta una millora de 4 cops. La combinació de l’EGE amb additius químics va resultar en una millora de 1.5 cops en la producció de VLPs de VIH- 1 comparat amb l’EGE sola. Com alternativa a l’ús d’additius químics, es va provar l’expressió de shRNA que produeixin el mateix efecte sobre les cèl·lules. Aquesta estratègia innovadora va millorar la producció de VLP en 2.3 cops sense cap detriment sobre la viabilitat cel·lular. Finalment, la combinació dels shRNA amb l’EGE va comportar una millora en la producció de VLPs de 1.3 cops, comparat amb el protocol tradicional d’EGE. En el segon capítol de la tesi, es va dur a terme l’escalat a nivell de reactor d’EGE, obtenint una producció de VLP comparable a l’erlenmeyer. El bioreactor va permetre l’assoliment de densitats cel·lulars i creixements específics molts més alts. Degut al major creixement en el bioreactor, el percentatge final de cèl·lules GFP positives era considerablement menor que a l’erlenmeyer, la qual cosa podria ser millorada ampliant el nombre de retransfeccions realitzades al cultiu cel·lular. L’anàlisi per quantificació de nanopartícules va revelar un ratio de VLPs respecte a partícules totals més alt en el cas de l’erlenmeyer que en el reactor; possiblement degut a les altes densitat cel·lulars del bioreactor. La metodologia d’EGE va poder ser escala satisfactòriament a nivell de reactor per primer cop, mantenint les produccions de GagGFP. En el tercer capítol, es va realitzar l’optimització de les concentracions de DNA i PEI usades a la transfecció transitòria per a tres línies HEK293 diferents i tres plasmidis d’expressió. Les concentracions de DNA i PEI optimitzades per a les nou combinacions van ser molt similar per tots el casos; el que ens indica que l’eficiència de transfecció depèn de la quantitat concreta de DNA i PEI emprada. A més, dues de les tres línies reconeixen orígens de replicació específics. Els orígens de replicació estan inclosos a les seqüències dels vectors per tal de provar la seva capacitat d’augmentar la producció de VLPs. El sistema HEK293E/OriP va ser l’escollit perquè permet una millora de la producció de VLPs de VIH-1 de 3 cops, mantenint les mateixes densitats i viabilitats cel·lulars comparat amb un plasmidi control. En l’últim capítol d’aquest treball, es va dur a terme la generació d’una línea estable de HEK293 per l’expressió de VLPs. Després d’un procés de selecció basat en la producció, es van seleccionen cinc clons per l’adaptació a suspensió i a medis lliures de sèrum. El clon 10H9 va presentar un temps de duplicació i una densitat cel·lular màxima semblant a la resta de clons i va assolir una la màxima productivitat específica; per tant, va ser seleccionat com a productor de VLPs.

Virus-like particles (VLP) have a high potential as candidates for vaccine development. In this work, several strategies are tested for VLP production enhancement in HEK293 cells by transient gene expression (TGE) and stable gene expression (SGE). The VLP of interest is based on HIV-1 Gag polyprotein which has potential applications in therapeutic AIDS vaccine development. Three chapters present strategies based on TGE while the last chapter consist of the generation of a stable HEK293 cell line for the production of HIV-1 VLPs. In the first chapter, the combination of extended gene expression (EGE) strategy with chemical additives supplementation was tested. EGE (based on repeated medium exchanges and retransfections) improves VLP production titers in 12-fold while chemical media supplementation leads to a 4-fold enhancement of VLP titers, despite their effect on cell viability. The combination of EGE protocol with chemical additives resulted in a 1.5-fold improvement in production compared with the EGE protocol alone (4.45x1010 VLPs/mL compared with 2.89x1010 VLPs/mL). As an alternative, the expression of shRNAs that could provide the same effects was also tested. This novel strategy enhanced VLP production by 2.3 fold without any detrimental effect on cell viability. Finally, the combination of shRNA with EGE resulted in more than 1.3-fold improvement compared with the EGE protocol traditionally used. In the second chapter, the scalability of EGE at bioreactor level was tested and the VLP production was compared to the results obtained in shake flasks. Cell viability was comparable between the two systems tested; however, the bioreactor enabled to reach much higher cell densities and specific growth rates than shake flasks. Due to this increased cell growth in the bioreactor, the final percentage of GFP-positive cells was considerably lower than in the shake flasks, which could be improved by performing further retransfections of the cell culture. GagGFP VLP titers were similar in both shake flasks and bioreactor. Nanoparticle tracking analysis revealed that the ratio of VLPs/total particles (VLPs and microvesicles) was higher in the shake flasks than in the bioreactor, possibly due to higher cell densities achieved in the bioreactor. EGE methodology was successfully carried out in a bioreactor system for the first time while maintaining GagGFP production titers. In the third chapter, DNA and PEI concentration optimization was carried out for three different HEK293 cell lines (HEK293SF-3F6, T and 6E) and three different expression plasmids (pSV40, p(-), and pOriP)). The concentration of DNA and PEI was optimized for the nine combinations and the obtained resulted are very similar in all cases (DNA: 2.34 ± 0.18 μg/mL; and PEI: 5.81 ± 0.18 μg/mL), revealing that transfection efficiency was not dependent on the cell line or vector type. Furthermore, two of the cell lines tested recognize specific origins of replication: HEK293T/SV40 and HEK293E/oriP. Origins of replication were included in the vector sequences to test their capacity to increase production titers. HEK293T/SV40 resulted in a decrease of cell density and productivity of 2.3 fold compared to a control plasmid. On the other hand, HEK293E/OriP platform enabled a 3-fold improvement in HIV-1 VLP production keeping the same cell densities and viabilities compared to a control plasmid. In the last chapter of this work, the generation of a stable HEK293 cell line expressing Gag VLPs was attempted through a random site integration strategy. After a screening process based on GagGFP production, five clones were selected for adaptation to suspension and serum-free conditions. 10H9 clone presents similar duplication time and maximum cell density than the other clones. Furthermore, 10H9 showed highest GagGFP productivity and also highest specific productivity and was hence the selected GagGFP producer HEK293 clone.