Novel functionalized and patterned surfaces for cardiovascular applications

Abstract

Nowadays, cardiovascular diseases are mainly treated by implantation of a metallic or polymeric mesh, called stent, which maintains the artery widely open. This technique shows very good clinical results, however, it exists non negligible cases of in stent restenosis (ISR) and late stent thrombosis (LST) during the first year after stent implantation. These complications are mainly due to a delayed recovery of the endothelium after stent implantation, which also involves smooth muscle cells (SMCs) over-proliferation and platelet aggregation. Stent surface modification to modulate a specific cell lineage response has not been comprehensively explored. In particular, surface nano topography, biofunctionalization or chemical features may be applied to increase endothelial cells (ECs) adhesion and/or migration, and to control platelet agglomeration. The overall aim of this thesis was to obtain novel modified surfaces for stents implants with the ability to induce accelerated reendothelialization and controlled platelet aggregation in order to avoid ISR and LST. On CoCr alloy, as the gold standard material for bare metal stents (BMSs), two different strategies were evaluated, generation of linear patterns by direct laser interference patterning (DLIP) and, immobilization of biomolecules. On poly(L-lactic acid) (PLLA), as a material for bioresorbable stents (BRSs), endothelialization was enhanced by surface functionalization with NaOH etching, plasma treatment and cutinase enzyme hydrolysis. CoCr alloy surfaces were successfully modified with a linear pattern of different periodicities and depths. Afterwards, Arg-Gly-Asp (RGD) and Tyr Ile Gly Ser Arg (YIGSR) peptides were covalently immobilized to the surfaces through silanization. Early ECs adhesion was improved on the peptide functionalized surfaces, especially for YIGSR compared to RGD. High depth nano patterned surfaces generated ECs alignment within the topographical lines and enhanced EC migration. Noteworthy, the combined use of both strategies, topography and biofunctionalization, synergistically accelerated the ECs migration and proliferation. Also, platelet adhesion and aggregation decreased in all patterned surfaces compared to smooth CoCr probably due to changes in wettability and oxide layer characteristics. Cellular studies provided evidence of the potential of DLIP topographies and YIGSR biofunctionalization to foster endothelialization without enhancement of platelet adhesion, which will be of high importance when designing new stents. Concerning polymeric biodegradable materials, PLLA films were obtained by solvent casting in chloroform and, oxygen plasma, NaOH solution or cutinase enzyme treatments were used to functionalize the PLLA films and create surface hydroxyl and carboxyl groups without compromising biocompatibility. A higher amount of functional groups and an improved ECs adhesion was observed by oxygen plasma and cutinase enzyme hydrolysis compared to NaOH etching. Plasma or cutinase enzyme functionalized PLLA films presented a degradation rate similar to a peripheral commercial stent. Finally, 3D printed PLLA BRSs were obtained by solvent-cast direct write technique. Consequently, the combined use of the solvent cast direct write technique and plasma or enzyme functionalization holds a great potential to fabricate 3D printed PLLA BRSs with the capacity to accelerate the surface endothelialization. Overall, the present thesis offers a comprehensive view of the effectiveness of modifying CoCr alloy and PLLA films with specific topographies or functionalization strategies to enhance surface endothelialization while preventing restenosis and thrombosis.

Heutzutage werden vaskuläre Erkrankungen hauptsächlich durch Implantation eines metallischen oder polymeren Netzes, genannt Stent, behandelt, welcher vormals verengte Arterien weit geöffnet hält. Diese Technik zeigt bereits sehr gute klinische Ergebnisse. Allerdings existieren auch nicht zu vernachlässigende Fälle von In-Stent Restenose (ISR) und späten Stentthrombosen (LST) im ersten Jahr nach Implantation des Stents. Diese Komplikationen entstehen hauptsächlich aufgrund einer verzögerten Erholung der Endothele nach Einsetzen des Stents, sowie durch übermäßiges Wachstums der vaskulären glatten Muskelzellen (SMCs) und einer Thrombozytenaggregation. Modifikationen der Stent-Oberfläche, um die Interaktion mit spezifischen Zellypen zu kontrollieren, sind noch nicht umfassend erforscht. Insbesondere können Oberflächen-Nano-Topographie, Biofunktionalisierung oder chemische Modifizierungen angewendet werden, um die Adhäsion und / oder Migration der Endothelzellen (ECs) zu erhöhen und die Agglomeration von Blutplättchen niedrig zu halten. Das Gesamtziel dieser Arbeit war es, neuartige modifizierte Oberflächen für Stentimplantate zu entwickeln, die die Reendothelialisierung beschleunigen und eine Thrombozytenaggregation verringern, um ISR und LST vorzubeugen. Auf einer CoCr-Legierung, dem Gold-Standard-Material für unbeschichtete Metallstents (BMSs), wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt; einerseits die Erzeugung linearer Muster durch direkte Laserinterferenzstrukturierung (DLIP) und Immobilisierung von Biomolekülen. Auf Poly (L-Milchsäure) (PLLA) als Material für bioresorbierbare Stents (BRSs) wurde die Endothelialisierung durch Oberflächenfunktionalisierung mit NaOH-Ätzen, mit einer Plasmabehandlung und mit Cutinase-Enzym-Hydrolyse verbessert. Zum anderen wurden Oberflächen einer CoCr-Legierung erfolgreich mit einem Linien-Muster unterschiedlicher Periodizität und Tiefe modifiziert. Anschließend wurden Arg-Gly-Asp (RGD) und Tyr-lle-Gly-Ser-Arg (YIGSR) Peptide durch Silanisierung kovalent an den Oberflächen immobilisiert. Die frühe ECs-Adhäsion wurde auf den Peptid-funktionalisierten Oberflächen verbessert, insbesondere für YIGSR im Vergleich zu RGD. Nanostrukturierte Oberflächen mit großer Tiefe erzeugten eine ECs-Ausrichtung innerhalb der topographischen Linien und förderten die EC-Migration und -Proliferation. Bemerkenswerterweise wurden diese synergetisch durch Kombination der zwei Strategien, Topographie und Biofunktionalisierung, beschleunigt. Auch die Thrombozytenadhäsion und –aggregation sanken in allen strukturierten Oberflächen verglichen mit glattem CoCr, möglicherweise auf Grund von Veränderungen der Benetzbarkeit und der Oxidschichteigenschaften. Zellstudien belegen das Potential von DLIP-Topographien und YIGSR-Biofunktionalisierung, um die Endothelialisierung ohne Erhöhung der Thrombozytenadhäsion zu fördern, was von großer Bedeutung bei der Entwicklung neuer Stents sein wird. In Bezug auf polymere biologisch abbaubaren Materialien wurden PLLA-Schichten durch Solvent-Casting in Chloroform hergestellt. Sauerstoffplasma, NaOh-Lösemittel oder Cutinase-Enzym-Behandlungen wurden genutzt, um die PLLA-Schichten zu funktionalisieren und Oberflächen-Hydroxylgruppen und -Carboxylgruppen herzustellen, ohne die Biokompatibilität zu beeinträchtigen. Im Vergleich zu NaOH-Ätzen wurden durch Sauerstoffplasma und durch Cutinase-Enzym-Hydrolyse eine höhere Anzahl an funktionellen Gruppen und eine verbesserte ECs-Adhäsion festgestellt. Plasma- oder Cutinase-Enzym-funktionalisierte PLLA-Schichten zeigten eine ähnliche Degradation wie ein peripher, kommerzieller Stent. Abschließend wurden 3D-gedruckte PLLA-BRSs durch Solvent-Cast Direct Writing hergestellt. Folglich bietet die Kombination aus Solvent-Cast Direct Writing und Plasma- oder Enzymfunktionalisierung ein großes Potenzial, 3D-gedruckte PLLA-BRSs mit beschleunigter Oberflächenendothelialisierung herzustellen. Insgesamt bietet die vorliegende Arbeit einen umfassenden Überblick über die Effektivität der Modifizierung von CoCr-Legierung und PLLA-Filmen mit spezifischen Topographien oder Funktionalisierungsstrategien zur Verbesserung der Oberflächenendothelialisierung bei gleichzeitiger Vermeidung von Restenose und Thrombose

Actualmente las enfermedades cardiovasculares están principalmente tratadas por implantación de una malla metálica o polimérica, llamada stent, que mantiene la arteria abierta. Esta técnica presenta muy buenos resultados clínicos, sin embargo, existen casos de reestenosis intra-stent (ISR) y trombosis tardia del stent (LST) durante el año que sigue la implantación. Estas complicaciones están principalmente debidas a una reparación demasiado lenta del endotelio después de la implantación del stent; que también implica una sobre-proliferación de células musculares lisas y una agregación de plaquetas. La modificación de la superficie del stent para generar una respuesta celular específica no ha sido explorada en profundidad. Particularmente, nano-topografía, biofuncionalización o modificaciones químicas pueden ser aplicadas para incrementar la adhesión y la migración de las células endoteliales (ECs), y para controlar la aglomeración de las plaquetas. El objetivo global de esta tesis es de obtener nuevas superficies modificadas para stent implantes con la habilidad de inducir una endotelización acelerada y de controlar la agregación de plaquetas. Sobre CoCr, material de referencia para los stent metálicos desnudos (BMSs), dos estrategias diferentes fueron evaluadas, la creación de patrones lineales por la técnica Direct Laser Interference Patterning (DLIP) y, la inmovilización de biomoléculas. Sobre acido L-poliláctico (PLLA), como material para stent biodegradables (BRSs), la endotelización fue activada por funcionalización de la superficie vía tratamientos con NaOH, plasma o enzima cutinasa. Patrones lineales de diferentes periodicidades y profundidades fueron obtenidos sobre superficies de CoCr. Después, los péptidos Arg-Gly-Asp (RGD) y Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) fueron enganchados covalentemente por silanización sobre les superficies de CoCr lisas y con patrones. La adhesión de ECs aumento sobre las superficies funcionalizadas, especialmente con el péptido YIGSR comparado con el RGD. Las superficies con patrones profundos generaron un alineamiento de las ECs con la dirección de las líneas del patrón y aceleraron la migración de esas mismas células. Además, el uso combinado de esas dos estrategias, topografía y biofuncionalización, acelero sinérgicamente la migración y la proliferación de las ECs. Por fin, la adhesión y la agregación de plaquetas disminuyo sobre todas las superficies con patrones comparado con las superficies de CoCr lisas, efecto causado por los cambios de la capa de óxido introducido por la técnica DLIP. Los estudios celulares demuestran el potencial de las topografías DLIP y de la biofuncionalización para mejorar la endotelización sin aumentar la adhesión de plaquetas, lo que puede ser interesante a la hora de diseñar nuevos stents. En cuanto a los stent biodegradables, películas de PLLA fueron obtenidas por la técnica de solvent-casting y, plasma de oxígeno, solución de NaOH o enzima cutinasa fueron utilizados para funcionalizar esas películas de PLLA y, así crear grupos hidroxilos y carboxilos en superficie sin comprometer la biocompatibilidad. Plasma de oxígeno y enzyma cutinasa generaron más grupos funcionales y mejoraron más la adhesión de ECs comparado con el tratamiento de NaOH. Además, las superficies de PLLA modificadas por plasma o enzima presentaron una degradación similar a la degradación de un stent comercial. Finalmente, BRSs de PLLA fueron obtenidos por impresión 3D vía la técnica de solvent-cast direct write. Consecuentemente, el uso combinado de esa técnica y de la funcionalización por plasma o enzima presenta un gran potencial para fabricar BRSs de PLLA impreso en 3D con la capacidad de acelerar la endotelización de la superficie. En conclusión, esta tesis demuestra la efectividad de modificar las superficies de CoCr o PLLA con topografías específicas o con estrategias de funcionalización para mejorar la endotelización y paralelamente reducir los riesgos de trombosis y reestenosis