Avaluació dels efectes de factors ambientals en organismes model mitjançant metodologies òmiques i quimiomètriques

Abstract

L’aplicació de tecnologies transcriptòmiques i metabolòmiques en estudis no dirigits té com a principal objectiu la caracterització global (funcional i estructural) dels transcrits de mRNA i dels metabòlits, respectivament, que conformen els sistemes biològics. En el camp mediambiental, aquestes dues aproximacions òmiques permeten avaluar i comparar els nivells d’aquestes molècules en els organismes vius en resposta a diferents estímuls o variacions en les condicions ambientals. D’aquesta manera, ambdues ciències proporcionen coneixement de les interaccions dels sistemes biològics amb el seu entorn a nivell molecular. En els estudis òmics no dirigits són imprescindibles les tècniques analítiques d’alt rendiment com la seqüenciació de RNA (RNA-Seq) i les tècniques de separació acoblades a l’espectrometria de masses, com per exemple la cromatografia de líquids i l’electroforesi capil·lar acoblades a l’espectrometria de masses (LC-MS i CE-MS, respectivament). Ara bé, els grans conjunts de dades generats en aquests estudis són complexos i fan necessari el desenvolupament i l’aplicació de mètodes estadístics i quimiomètrics multivariants d’anàlisi de dades, els quals permetin extreure la informació biològica rellevant i facilitar-ne la seva interpretació. Aquesta Tesi s’ha centrat especialment en el desenvolupament de mètodes analítics i quimiomètrics que puguin ser útils en aquests tipus estudis i en la seva aplicació en diversos casos d’interès ambiental i toxicològic on es pren el peix zebra com a organisme model. D’una banda, s’ha treballat en el desenvolupament i optimització de mètodes analítics de LC-MS i CE-MS i de tractament de dades multivariants per a estudis de metabolòmica no dirigida. S’ha avaluat la influència de diferents factors experimentals en la separació de metabòlits mitjançant la cromatografia de líquids d'interacció hidrofílica (HILIC) (per exemple, la fase estacionària, el pH, la força iònica i el modificador orgànic). També, s’han optimitzat les condicions experimentals per a l’anàlisi metabolòmica no dirigida mitjançant la tècnica de CE-MS. D’altra banda, s’han presentat diferents estratègies de tractament de dades metabolòmiques no dirigides basades en la resolució multivariant de corbes per mínims quadrats alternats (MCR-ALS), les quals permeten la detecció i la identificació dels metabòlits de les dades de LC-MS i CE-MS. Finalment, s’ha aplicat la compressió

de les dades de cerca de regions d’interès (ROI) i la resolució per MCR-ALS (mètode ROIMCR) per a l’estudi simultani o fusió de conjunts de dades que provenen de diferents plataformes de MS. La idoneïtat de totes aquestes metodologies analítiques i quimiomètriques s’ha demostrat en estudis comparatius dels perfils metabòlics de mostres de llevat (Saccharomyces cerevisiae) en diferents condicions de creixement estressants. Un segon aspecte d’aquesta Tesi ha estat l’aplicació de les metodologies prèviament proposades en la investigació dels possibles efectes de diferents compostos disruptors endocrins, com ara el bisfenol A (BPA), el sulfonat de perfluorooctà (PFOS) i el tributilestany (TBT), en embrions de peix zebra (Danio rerio). En concret, s’ha detectat que els tres contaminants produeixen importants alteracions en el metabolisme dels embrions, produint efectes tòxics, estrès oxidatiu i alteracions en la proliferació cel·lular, a més d’efectes específics en vies de senyalització. Addicionalment, s’han postulat noves hipòtesis sobre els efectes toxicològics i morfològics adversos d’aquests compostos químics. En el cas del BPA s’ha realitzat, a més, un estudi transcriptòmic no dirigit de seqüenciació de RNA (RNA-Seq), que ha permès obtenir informació addicional a l’extreta a nivell metabolòmic, la qual cosa permet una comprensió més global i conjunta del mecanisme d’acció del BPA en el metabolisme dels embrions.

The application of transcriptomic and metabolomic technologies in non-targeted studies is primarily based on the global (functional and structural) characterization of mRNA transcripts and metabolites, respectively, in biological systems. In the environmental field, these two omic approaches aim at the evaluation and comparison of the abundances of these molecules in biological organisms in response to external stimuli. In this way, both omic sciences provide knowledge about the interactions of the biological systems with their environments at the molecular level. Non-targeted transcriptomics and metabolomics have progressed due to advances in high-performance analytical techniques, such as RNA-sequencing (RNA-Seq) and separation techniques coupled with mass spectrometry (e.g., liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS; and capillary electrophoresis-mass spectrometry, CE- MS). However, datasets generated in these studies are large and complex. Therefore, the development and application of multivariate chemometric data analysis methods are mandatory to extract the relevant information and achieve a reliable biological interpretation. The first half of this thesis focuses on the development and optimization of LC-MS and CE-MS methodologies in combination with advanced chemometric tools for non-targeted metabolomic studies. Firstly, the influence of different experimental factors in the separation of metabolites by hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC), such as the type of stationary phase, the organic modifier and the pH and the ionic strength of the mobile phase, was evaluated. Also, the experimental conditions for a non-targeted metabolomic analysis using CE-MS technique were optimized. Secondly, different data treatment strategies based on the use of multivariate curve resolution by alternating least squares (MCR-ALS) for the detection and identification of the metabolites from non-targeted LC-MS and CE-MS metabolomics data were presented. Finally, the search of the regions of interest (ROI) data compression in combination with MCR-ALS resolution (so-called ROIMCR method) was applied for the simultaneous study or fusion of datasets from different MS platforms. The suitability of all these analytical and chemometric methodologies was

shown in comparative studies of the metabolic profiles of yeast (Saccharomyces cerevisiae) samples under different growth stressors. The second half of this thesis deals with the application of the previously proposed methodologies in the investigation of the effects of different endocrine disrupting compounds (e.g., bisphenol A, BPA; perfluorooctane sulfonate, PFOS; and tributyltin, TBT) on zebrafish (Danio rerio) embryos. These three pollutants produced important alterations on embryo metabolism, causing toxic effects, oxidative stress and alterations in cell proliferation, as well as specific effects in signaling pathways. Additionally, new hypotheses were postulated on the adverse toxicological and morphological effects of these chemical compounds. In order to extract more information about BPA effects on the exposed embryos, a non-targeted transcriptomic approach based on RNA-Seq was performed. Overall, the combination of the knowledge coming from both omic levels allowed a global understanding of the mechanism of action of BPA on embryo metabolism.