Sortida del virus de l'hepatitis A dels hepatòcits: implicacions en la selecció d'antivirals

Abstract

El virus de l’hepatitis A (HAV), el prototip del gènere Hepatovirus, té una sèrie de característiques que el diferencien de la resta de membres de la família Picornaviridae. Entre aquestes, la via de sortida descrita recentment a través dels cossos multivesiculars al interior d’exosomes, ha provocat un canvi de paradigma important en la biologia del virus de l’HAV. El mecanisme de classificació de l’HAV dins de les vesícules intraluminals dels cossos multivesiculars, implica la interacció de la càpsida del virus amb la proteïna ALIX. En el present treball, utilitzant dues soques de l’HAV que difereixen en la seva capacitat de replicació, es mostra com la proteïna ALIX té un paper important en la formació de les partícules pseudoembolcallades de l’HAV en els hepatòcits humans. Gran part de les partícules virals alliberades en els sobrenedants de cultiu in vitro presenten el fenotip pseudoembolcallat del virus de l’HAV. Els hepatòcits humans (línia cel·lular Huh7-AI) responen a la replicació del virus augmentant els nivells d’expressió del mRNA d'ALIX. Les cèl·lules Huh7-AI infectades amb una soca de creixement ràpid de l’HAV (HM175-HP; HP) mostren un augment significativament superior de l'expressió d’ALIX, respecte les cèl·lules infectades amb una soca de creixement lent (HM175-L0; L0). Addicionalment, la soca HP mostra ser molt menys sensible al silenciament d'ALIX que la soca L0. L'anàlisi a través de microscòpia confocal quantitativa de la càpsida de l’HAV i la proteïna ALIX en cèl·lules Huh7-AI, mostra una major proporció de càpsides d’HP que colocalitzen amb ALIX que en L0. Aquests resultats suggereixen una major eficiència d’interacció de les càpsides d’HP amb ALIX, que correlaciona directament amb la major quantitat de càpsides alliberades a l’interior d’exosomes per part d’aquesta soca de l’HAV. El fenotip de creixement ràpid de la soca HP respon a una combinació de funcions les quals inclouen, un IRES més eficient, un ús optimitzat de codons i una major eficiència de sortida de la cèl·lula. A més, aquest treball mostra com el mecanisme de sortida del virus pot ser un bon objectiu per a l’estudi de noves teràpies antivirals basades en la inhibició de la sortida del virus. L’estudi mostra com el ionòfor monensina pot ser un bon candidat com a potencial antiviral multidiana per a l’HAV. Aquesta droga, utilitzada per a la inhibició de la via de sortida, mostra també efectes inhibidors sobre les fases inicials del cicle del virus.

Hepatitis A virus (HAV) is a hepatotropic member of the Picornaviridae family with very special molecular features. Among these features, an unexpected exit pathway through its envelopment into exosomes has been recently described. The mechanism of HAV sorting into the exosome-containing multi-vesicular bodies involves the interaction with the ALIX protein. In the present work using two HAV strains, which differ in their replication capacity, we show that indeed ALIX plays a role in the formation of HAV quasi-enveloped particles in human hepatocytes. Human hepatocytes (Huh7-AI cell line) show an increased level of expression of ALIX over time, and they respond to virus replication by increasing the levels of ALIX mRNA synthesis. Huh7-AI cells infected with a fast-growing strain of HAV (HM175-HP; HP) showed an increase of ALIX expression compared to cells infected with a slow-growing strain (HM175-L0; L0). Additionally, the HP strain showed to be much less sensitive to ALIX silencing than the L0 strain. Analysis of quantitative confocal microscopy of the capsid protein and ALIX, in Huh7-AI cells, revealed a higher proportion of HP capsids rather than L0 capsids co-localizing with ALIX. These results point out to a more efficient interaction of HP capsids with ALIX, which correlates with a higher release of capsid containing-exosomes in the HP population. The fast-growing phenotype of the HP strain respond to a combination of features including a more efficient IRES, an optimized codon usage and a more efficient system to egress from the cell. Moreover, this work shows how the mechanism of virus egress could be a potential target for new antiviral therapy.