Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality

Abstract

L’anàlisi del cortisol circulant, el producte final de l’activació de l’eix hipotalàmic-pituïtariinterrenal (HPI), ha sigut la metodologia més usada en els estudis d’estrès en peixos. Per evitar els inconvenients inherents al mostreig de sang, el cortisol es pot analitzar de forma menys invasiva en el mucus cutani dels peixos. Les concentracions de cortisol mesurades en el mucus han demostrat ser un bon indicador d’estrès en peixos de piscifactoria exposats a diferents tipus d’estrès agut. Atès que aquest tipus de mostra reflexa l’activitat de l’eix HPI a curt termini, i el creixent interès de la comunitat científica en estudiar increments crònics de cortisol, recentment les escates dels peixos han resultat ser un biomaterial amb capacitat de reflectir l’activitat de l’eix HPI a llarg termini. Al tractar-se de matrius relativament noves, encara falten molts aspectes per conèixer, principalment aquells relacionats amb la capacitat d’aquestes matrius per reflectir l’activitat de l’eix. A més, la mesura de cortisol en mucus i en escata de peixos en estat salvatge podria oferir avantatges tant pràctics com conceptuals. Tot i així, abans d’usar aquestes mesures en fauna salvatge amb finalitats de conservació i/o gestió, entre d’altres, cal fer una validació biològica exhaustiva de cada una d’elles. Així doncs, aquesta tesis es va realitzar amb l’objectiu general de validar la mesura de cortisol en mucus cutani (MCC per les seves sigles en anglès) i en escates (SCC) i avaluar l’ús d’aquests mètodes com a eines potencials per estudiar la qualitat de l’hàbitat. Primer, es va validar satisfactòriament el protocol d’extracció d’hormones en aquestes mostres i la quantificació de cortisol mitjançant enzim immunoassaig. Un cop validada la part metodològica, es va estudiar la capacitat de les MCC i les SCC per representar esdeveniments biològics d’interès. Les MCC van demostrar reflectir amb més exactitud les respostes agudes d’estrès que les cròniques. Els resultats també van revelar que les MCC es poden usar com una metodologia alternativa i no invasiva per avaluar l’activitat de l’eix HPI del peix salvatge de riu de l’espècie Squalius laietanus (bagra catalana) en el seu hàbitat natural. Finalment, les SCC van demostrar oferir informació integrada, retrospectiva i a llarg termini de l’activitat de l’eix HPI en peixos sotmesos a situacions d’estrès crònic i continuat. Un cop demostrada la importància biològica d’ambdós matrius, es possible estudiar si aquestes dues mesures són igualment vàlides per a ser potencialment usades com a bioindicadores de la qualitat de l’hàbitat. Es va observar que els peixos que residien en habitats amb un grau de pol·lució diferent presentaven diferències significatives en les MCC, suggerint que aquesta eina podria ser usada com a bioindicador de la qualitat de l’hàbitat en peixos que habiten aigües contaminades. Tot i que no es van observar diferències en SCC entre hàbitats, les SCC van augmentar de forma significativa coincidint amb un període potencialment estressant per l’espècie. Aquests resultats podrien indicar que les SCC estan més influenciades per períodes transitoris energèticament exigents que per factors estressants crònics. En general, aquesta tesi ofereix una base per futurs estudis que usin el mucus cutani i les escates per mesurar les concentracions de cortisol en peixos, així com també demostra el seu potencial per a ser usada com a eina d’avaluació d’impacte ambiental en fauna salvatge. A més, obre noves línies de recerca que s’haurien d’abordar per tal de clarificar encara més l’elevat potencial d’aquestes matrius com a mesures d’estrès en peixos.

El análisis del cortisol circulante, el producto final de la activación del eje hipotalámicopituitario- interrenal (HPI), ha sido la metodología más usada en los estudios de estrés en peces. Para evitar los inconvenientes inherentes al muestreo de sangre, el cortisol se puede analizar de forma menos invasiva en la secreción mucosa cutánea de los peces. Las concentraciones de cortisol en mucus han demostrado ser un buen indicador de estrés en peces de piscifactoría expuestos a diferentes tipos de estrés agudo. Dado que este tipo de muestra refleja la actividad del eje HPI a corto plazo, y el creciente interés de la comunidad científica en estudiar los incrementos crónicos de cortisol, recientemente, las escamas de los peces han resultado ser un biomaterial con la capacidad de reflejar la actividad del eje HPI a largo plazo. Al tratarse de medidas relativamente nuevas, aún faltan muchos aspectos por estudiar, principalmente los relacionados con la capacidad de estas muestras para reflejar la actividad del eje. Además, la medición de cortisol en mucus y en escamas de peces en estado salvaje podría ofrecer ventajas tanto prácticas como conceptuales. Aún así, antes de ser usadas con finalidades de conservación o gestión, entre otras, es necesario hacer una validación biológica exhaustiva de cada una de estas matrices. Por lo tanto, esta tesis se realizó con el objetivo general de validar la medición de cortisol en mucus cutáneo (MCC por sus siglas en inglés) y en escama (SCC), y evaluar el uso de estos métodos como potenciales herramientas para estudiar la calidad del hábitat. En un primer lugar, se validó satisfactoriamente el protocolo de extracción de hormonas en estas matrices y la cuantificación de cortisol mediante inmunoensayo enzimático. Con la metodología validada, estudiamos la capacidad de MCC y SCC para representar eventos biológicos de interés. La MCC demostró reflejar con más exactitud la respuesta aguda de estrés que la crónica. Además, los resultados también revelaron que las MCC podrían ser usadas como una metodología alternativa y no invasiva para evaluar la actividad del eje HPI en peces salvajes de río de la especie Squalius laietanus (bagra catalana) en su hábitat natural. Finalmente, las SCC demostraron ofrecer información integrada, retrospectiva y a largo plazo de la actividad del eje HPI en peces sujetos a situaciones de estrés crónico y continuado. Habiendo demostrado la importancia biológica de ambas matrices, pudimos estudiar si estas dos medidas son igualmente válidas para ser potencialmente utilizadas como bioindicadoras de la calidad del hábitat. Se observó que los peces residentes de hábitats con diferente grado de polución presentaban diferencias significativas en las MCC, sugiriendo que esta herramienta podría ser usada como bioindicador de la calidad del hábitat en peces que habitan aguas contaminadas. Aunque no se detectaron diferencias en las SCC entre hábitats, las SCC aumentaron de forma significativa coincidiendo con un periodo potencialmente estresante para la especie. Estos resultados podrían indicar que las SCC están más influenciadas por periodos transitorios energéticamente exigentes que por factores estresantes crónicos. En general, esta tesis ofrece una base para futuros estudios que utilicen el mucus cutáneo y las escamas para medir las concentraciones de cortisol en peces, a la vez que demuestra el potencial de estas matrices para poder ser usadas como herramientas de evaluación de impacto ambiental en fauna salvaje. Además, abre nuevas líneas de investigación cuyo abordaje puede clarificar, aún más, el elevado potencial de estas matrices como medidas de estrés en peces.

The analysis of circulating cortisol, the end product of the hypothalamic-pituitary-interrenal (HPI) axis activation, has been by far the most common method used as a means to assess fish stress responses. To avoid the drawbacks inherent to blood sampling, cortisol can be lessinvasively analysed in fish skin mucus. The measurement of cortisol concentrations in skin mucus has been shown to be a good stress indicator in farm fish exposed to different acute stressors. Given that this type of sample reflects the short-term activity of the HPI axis, and the growing interest in assessing chronic increases of cortisol, fish scales have been recently recognized as a biomaterial able to reflect the long-term HPI axis activity. There are, however, primary gaps in the knowledge on the degree to which the cortisol content in these samples represents the activity of the HPI axis. In addition, cortisol measurement in both skin mucus and scale samples could offer many practical and conceptual advantages when being applied in wildlife. Nevertheless, before being employed in free-ranging animals for conservation, management or other purposes, each of these new matrices needs to be fully biologically validated. Accordingly, the present thesis was conducted with the general objective to validate the measurement of skin mucus cortisol concentrations (MCC) and scale cortisol concentrations (SCC) and evaluate the applicability of these methods as potential tools to assess habitat quality. We first validated a protocol for hormone extraction in these matrixes and the quantification of cortisol by enzyme immunoassay. After methodological validation, we aimed to examine whether MCC and SCC reflect biological events of interest. Levels of MCC demonstrated to reliably reflect acute stress responses, however, we suggest caution when applying this method for chronic stress assessments. Findings also revealed that MCC could be used as an alternative, non-invasive approach to assess the HPI axis activity in a wild freshwater fish (Catalan chub, Squalius laietanus) within its natural environment. Finally, measurements of SCC proved to reliably offer a retrospective, long-term, integrated measure of the HPI axis activity in fish subjected to long-term continuous stress. Having demonstrated the biological significance of both matrices, it is possible to study whether these measures are equally valid as potential bioindicators of habitat quality. Levels of MCC differed between habitats of different pollution gradient revealing that this metric could be potentially used as a bioindicator of habitat quality in fish residing contaminated streams. Although SCC remained unchanged between habitats, we observed an increase in SCC concurring with a temporarily stressful period, suggesting that transient energetically demanding periods could influence the deposition of cortisol in fish scales. Overall, this thesis offers guidance on the future measurement of cortisol levels in both skin mucus and scales, and its potential use in evaluating environmental impacts in free-living organisms. Moreover, it opens up new relevant research questions that should be addressed to further illustrate the high potential of skin mucus and scale cortisol as a proxy measure for stress.