Photosensitizers and microparticles as tools against malignant cells

Abstract

En els últims anys, s’han desenvolupat diverses estratègies per destruir específicament cèl·lules canceroses i minimitzar els efectes secundaris sobre cèl·lules sanes. Una d’estes estratègies és la teràpia fotodinàmica (PDT), una tècnica que utilitza un fotosensibilitzant (PS) juntament amb una longitud d’ona concreta, en presència d’oxigen. En excitar el PS es produïxen espècies reactives de l’oxigen (ROS) que matarien les cèl·lules del voltant. Per dirigir selectivament els PSs cap a les cèl·lules diana, estos es poden vehicular en nano- i micropartícules (NPs i µPs, respectivament). En eixe sentit, biofuncionalitzar NPs o µPs amb PSs y molècules capaces de reconéixer les cèl·lules malignes hauria de permetre fer tractaments més selectius amb PDT. Altra estratègia per destruir cèl·lules malignes és l’ús d’altres fàrmacs terapèutics que interaccionen amb dianes intracel·lulars per induir la mort cel·lular. Estos fàrmacs també poden ser vehiculitzats en NPs o µPs per dirigir-los més eficientment a les cèl·lules diana, però la major limitació d’este enfoc és que després de la internalització poden quedar atrapades junt als seus vehicles al compartiment endolisosomal. Per superar este problema, s’han desenvolupat estratègies com la internalització fotoquímica (PCI), que es basa en els mateixos principis que la PDT però, en este cas, el PS s’acumula en les membranes endolisosomals, que patixen disrupció despuix de l’excitació del PS, permetent l’alliberació del contingut endolisosomal cap al citosol. L’objectiu de la present tesi és contribuir al desenvolupament de les estratègies mencionades prèviament per eliminar selectivament cèl·lules malignes. En el primer treball, els tractaments fotodinàmics amb dos PSs (Na-H2TCPP i el seu derivat de zinc Na-ZnTCPP) induïren un descens en la supervivència de cèl·lules tumorals (SKBR3) i no tumorals (MCF10A), encara que este últimes mostraren una major resistència a baixes concentracions dels dos PSs. A més, depenent del PS i la línia cel·lular es van desencadenar diferents mecanismes de mort cel·lular, fet que podria explotar-se per protegir selectivament les cèl·lules no malignes en front dels tractaments fotodinàmics. En el segon treball es va demostrar que HER2, sobreexpressat en cèl·lules d’alguns tipus de càncer, era una diana adequada per dirigir µPs biofuncionalitzades amb anti-HER2. També demostràrem que diferents condicions de cultiu (monocultius o cocultius en sistemes estàtics o microfluídics) influenciaven la internalització de les µPs, posant en relleu la importància de realitzar estudis sobre les interaccions entre µPs i cèl·lules en condicions més similars a les existents in vivo. Finalment, en el nostre tercer treball observàrem que la PCI induïx eficaçment la disrupció de les membranes endolisosomals, permetent l’alliberació de molècules solubles cap al citosol, però no una desintegració completa de la membrana, fet que seria necessari per l’alliberació de les µPs atrapades. En conclusió, la present tesi proporciona nou coneiximent pel desenvolupament de millors agents terapèutics y tractaments basats en l’ús de PSs i µPs per la destrucció selectiva de cèl·lules malignes.

En los últimos años, se han desarrollado diversas estrategias para destruir específicamente células cancerosas y minimizar los efectos secundarios en células sanas. Una de estas estrategias es la terapia fotodinámica (PDT), una técnica que utiliza un fotosensibilizante (PS) y luz de una longitud de onda concreta, en presencia de oxígeno. Cuando el PS es excitado por la luz, produce especies reactivas del oxígeno (ROS) que inducen la muerte de las células circundantes. Para dirigir selectivamente los PSs hacia las células diana, éstos pueden vehiculizarse en nano- y micropartículas (NPs y µPs, respectivamente). En este sentido, biofuncionalizar NPs o µPs con PSs y con moléculas capaces de reconocer las células malignas debería permitir hacer tratamientos más selectivos con PDT. Otra estrategia para destruir células malignas es el uso de otros fármacos terapéuticos que interaccionen con dianas intracelulares para matar la célula. Estos fármacos también pueden ser vehiculizados en NPs o µPs para dirigirlos con más eficiencia a las células diana, pero la mayor limitación de este enfoque es que tras la internalización pueden quedar atrapados junto a sus vehículos en el compartimento endolisosomal. Para superar este problema, se han desarrollado estrategias como la internalización fotoquímica (PCI), que se basa en los mismos principios que la PDT pero, en este caso, el PS se acumula en las membranas endolisosomales, que sufren una disrupción tras la excitación del PS, permitiendo la liberación del contenido endolisosomal hacia el citosol. El objetivo de la presente tesis es contribuir al desarrollo de las estrategias mencionadas previamente, para eliminar selectivamente células malignas. En el primer trabajo, los tratamientos fotodinámicos con dos PSs (Na-H2TCPP y su derivado de zinc Na-ZnTCPP) indujeron un descenso en la supervivencia de células tumorales (SKBR3) y no tumorales (MCF10A), aunque éstas últimas mostraron mayor resistencia a bajas concentraciones de ambos PSs. Además, según el PS y la línea celular se desencadenaron diferentes mecanismos de muerte celular, hecho que podría explotarse para proteger selectivamente las células no malignas durante los tratamientos fotodinámicos. En el segundo trabajo, se demostró que HER2, sobreexpresado en células de algunos tipos de cáncer, era una diana adecuada para dirigir µPs biofuncionalizadas con anti-HER2. También demostramos que diferentes condiciones de cultivo (mono o cocultivos en sistemas estáticos o microfluídicos), influenciaban la internalización de las µPs, lo que puso de relieve la importancia de realizar estudios sobre las interacciones entre µPs y células en condiciones más similares a las existentes in vivo. Finalmente, en nuestro tercer trabajo observamos que la PCI induce eficazmente la disrupción de las membranas endolisosomales, permitiendo la liberación de moléculas solubles hacia el citosol, pero no una desintegración completa de la membrana, lo que sería necesario para la liberación de las µPs atrapadas. En conclusión, la presente tesis proporciona nuevo conocimiento para el desarrollo de mejores agentes terapéuticos y tratamientos basados en el uso de PSs y µPs para la destrucción selectiva de células malignas.

In the last years, different strategies have been developed to specifically destroy cancer cells minimizing side effects on healthy ones. One of these strategies is photodynamic therapy (PDT), a technique that uses a photosensitizer (PS) in combination with a specific wavelength in the presence of oxygen. When the PS is excited, reactive oxygen species (ROS) are produced, which would kill the surrounding cells. To selectively direct PSs to target cells, they can be attached to drug carries, like nano- and microparticles (NPs and µPs, respectively). In this way, biofunctionalizing NPs or µPs with PSs and molecules able to recognize malignant cells would improve cell targeting, increasing the effectivity of PDT. Another strategy to destroy malignant cells is the use of other therapeutic drugs that interact with intracellular targets to kill the cell. These drugs can also be carried by NPs or µPs to improve cell targeting, but the main limitation of this approach is their entrapment in the endolysosomal compartment after internalization by cells. To overcome this problem, escape enhancing strategies have been developed, like photochemical internalization (PCI), which is based in the same principles as PDT, but in this case the PS must accumulate in the endolysosomal membranes. In this way, disruption of the endolysomal membranes after PS excitation would allow the release of the endocytosed cargo. The aim of the present thesis is to contribute in the development of the aforementioned strategies for the selective destruction of malignant cells. In the first work, photodynamic treatments with two PSs (Na-H2TCPP and its zinc derivative Na-ZnTCPP) were found to induce a decrease in cell survival in both tumoral (SKBR3) and non-tumoral (MCF10A) cells, though the latter showed higher resistance at low PSs concentrations. Moreover, different cell death mechanisms were triggered depending on both the PS and the cell line, a result that could be exploited to selectively protect non-malignant cells in photodynamic treatments. In a second work, HER2 was found to be a suitable target to direct anti-HER2 biofunctionalized µPs to a tumorigenic cell line overexpressing this receptor. We also demonstrated that different culture conditions (monoculture or coculture in static or microfluidics systems) influenced µPs internalization, emphasising the importance of performing in vitro studies on cells- µPs interactions in an environment more similar to in vivo conditions (cocultures in microfluidic systems). Finally, in our third work, we found that PCI effectively induces endolysosomal membrane disruption, allowing the release of soluble molecules into the cytosol, but not complete membrane disintegration, which would be needed for the release of entrapped µPs. In conclusion, the present thesis provides new knowledge towards the development of better therapeutic agents and treatments based on the use of PSs and µPs for the selective destruction of malignant cells.