Development of tools for monitoring and controlling cell cultures through the metabolic analysis

Abstract

Les cèl·lules de mamífer esdevenen un dels principals sistemes per a la producció d'una àmplia gamma de proteïnes. Al voltant del 60-70% de tots els productes biofarmacèutics es produeixen en cèl·lules de mamífer gràcies a la capacitat d'aquestes cèl·lules de realitzar complexes modificacions post-translacionals per produir proteïnes biològicament actives. Una de les principals limitacions de les cèl·lules de mamífer és el seu ineficient metabolisme en cultiu, caracteritzat pel consum de grans quantitats de glucosa i la alta producció de subproductes no desitjats, com l'amoníac i el lactat, que afecten negativament el creixement cel·lular. En el treball presentat en aquesta tesi, s’observa que sota certes condicions de cultiu, les cèl·lules de mamífer son també capaces de consumir el lactat, mantenint-se en la fase de creixement exponencial. Els capítols 3 i 4 es centren en presentar les diferents fases del metabolisme de la glucosa i lactat en dues línies cel·lulars: HEK293 i CHO. Depenent de les condicions de cultiu, s'han obtingut tres metabolismes diferents: Fase 1: consum de glucosa i producció de lactat (creixement exponencial), Fase 2: consum simultani de glucosa i lactat (creixement exponencial) i Fase 3: consum de lactat com a única font de carboni (sense creixement cel·lular). L’obtenció d’aquestes diferents fases metabòliques depèn principalment de dues condicions de cultiu: el pH i la concentració extracel·lular de lactat. Per realitzar un estudi més profund de les diferents fases presentades, s'ha realitzat un anàlisi de la distribució de flux intracel·lular mitjançant un Flux Balance Analysis (FBA). Aquest anàlisi demostra que, a la Fase 1, la generació de lactat es deguda a que el piruvat es converteix en lactat per complir els requisits de regeneració de NADH en el citoplasma i només una petita quantitat de piruvat s'introdueix en el TCA a través del Acetyl-CoA. En el consum concomitant de glucosa i lactat (Fase 2), el consum de glucosa es redueix significativament i es s’aconsegueix un equilibri entre la glicòlisi i els fluxos del TCA, produint un consum de substrats molt més eficient. Un cop entès el metabolisme de les cèl·lules de mamífer en cultiu, el següent pas és aplicar aquest coneixement en l'àrea de l’enginyeria de bioprocessos. Amb aquesta finalitat, en el capítol 5 es presenta una nova eina de monitoratge en línia en Bioreactor basada en la mesura de l'addició de base per mantenir el pH constant. Aquesta nova eina és comparada amb una eina de monitoratge àmpliament utilitzada basada en la mesura de la velocitat de consum d’oxigen (O.U.R.), mitjançant l'aplicació del mètode dinàmic. Les dues alternatives presentades han demostrat avantatges clars pel que fa a la concentració de producte final i, especialment, a les productivitats volumètriques. No obstant això, s'han obtingut millors resultats amb l'estratègia basada en l'addició de base, augmentant la concentració total de cèl·lules viables i la concentració final de producte en un 178% i un 257%, respectivament, i obtenint un increment del 109% de la productivitat volumètrica del procés respecte al cultiu de referència en Batch. Aquesta diferència entre les dues estratègies aplicades es deu a les distorsions constants que pateix el cultiu en quant al pO2 i pH realitzades a cada mesura de la velocitat de consum d’oxigen amb el mètode dinàmic. Per tancar el treball realitzat, en el capítol 6 es presenta un mètode no invasiu per a la determinació de la O.U.R. com alternativa al mètode dinàmic. Els resultats demostren que el mètode desenvolupat és una alternativa fiable per monitoritzar l'activitat metabòlica, sent una eina útil per a la implementació d'estratègies de cultiu on la finalitat és l’obtenció d’altes densitats cel·lulars basades en el seguiment de la O.U.R..

Mammalian cells are well established systems for the production of a wide range of high added value proteins. About 60-70% of all biopharmaceuticals are produced in mammalian cells due to the capacity of these cells to perform complex post-translational modifications to yield biologically active proteins. One of the most important limitations of mammalian cells is their inefficient metabolism, characterized by the consumption of large quantities of glucose and concomitant production of similar amounts of by-products, like ammonia and lactate, which can detrimentally affect the cell growth. Interestingly, we have observed that under certain culture conditions mammalian cells are able to co-consume both glucose and lactate during the exponential growth phase. Chapters 3 and 4 are focused on presenting the different glucose and lactate metabolisms in cultures of HEK293 and CHO. Three different glucose and lactate metabolisms have been obtained: Phase 1: glucose consumption and lactate production (exponentially growth), Phase 2: glucose and lactate simultaneous consumption (exponentially growth), and Phase 3: lactate consumption as a sole carbon source (no cell growth). These different metabolic phases were observed mainly depending on two cell culture conditions: the pH and the lactate concentration. In order to perform a deeper study of the different phases presented, an analysis of the intracellular flux distribution for the different phases have been performed for both cell lines by means of Flux Balance Analysis (FBA). FBA showed that, in Phase 1, lactate is produced because pyruvate is converted to lactate to fulfill the NADH regeneration requirements in the cytoplasm and only a small amount of pyruvate is introduced into TCA through Acetyl-CoA. In glucose-lactate concomitant consumption (Phase 2), glucose uptake was significantly reduced and a balance between glycolysis and TCA cycle fluxes was reached, yielding a more efficient substrate consumption. Once understood the metabolism of mammalian cells in culture, the next step is to apply this knowledge in the engineering bioprocess area. To this end, a new robust on-line monitoring tool based on the alkali buffer addition used to maintain the pH set-point is presented in Chapter 5. This new tool is compared with a widely used monitoring tool based on the Oxygen Uptake Rate (O.U.R.) determination, by means of application of the dynamic method. The two alternatives presented have shown clear advantages in respect to final product titer and, especially, volumetric productivities. But better results have been obtained with the alkali addition strategy, increasing the total viable cell concentration and product titer by 178% and 257% respectively, and obtaining a 109% increment of the process volumetric productivity in respect to the batch culture. This is due to the culture constant distortions of the pO2 and pH performed in every O.U.R. dynamic measurement. To close the work performed, a different non-invasive method for O.U.R. determination based on the stationary liquid mass balance was presented and tested in batch culture in Chapter 6. The results demonstrated to be a reliable alternative to monitor the metabolic activity in bioreactors, being a useful tool for high cell density culture strategies implementation based on O.U.R. monitoring.