Stimulation of wound healing and vascularization with calcium-releasing biomaterials

Abstract

Chronic skin wounds are a major socioeconomic burden in developed societies, affecting specially elder and diabetic people. It is estimated that 1 to 2% of the population will suffer a chronic wound in their lifetime and, as global population ages and adopts a sedentary lifestyle, the incidence of these wounds will continue its upward trend. Chronic injuries are characterized for presenting a complicated and diverse pathophysiology that make them resistant to current therapies. For this reason, novel therapeutic strategies based on the release of growth factors and the use of tissue engineered constructs are being investigated and show promising results. However, very few biologically based products reach the market, mainly due to regulatory, economic and stability constraints, amplifying the need for easily translational novel treatments. Recently, inorganic biomaterials known as bioceramics have been acknowledged for their wound healing and vascularization capability, mainly due to their ion release. Based on this concept, the present thesis project was dedicated to investigate the potential application of novel bioceramics on wound healing and soft tissue regeneration. More specifically we focused on the role of the calcium ion and its release from newly designed bioceramics to stimulate wound healing and blood vessel formation in both in vitro and in vivo systems. Although it is known that calcium affects all the phases of wound healing, the concentrations and release profile that can improve the healing process has not been described. For this reason, we evaluated the effect of different concentrations of extracellular calcium in vitro on dermal fibroblast, a crucial cell type in the skin and the healing process, and found stimulation of relevant biological responses at specific concentrations. In addition, we compared whether similar effects could be obtained with the ion release of newly designed bioceramic particles containing equivalent calcium concentrations. Interestingly, while stimulating most of the effects, the ion release inhibited some responses triggered by calcium alone that are not desired in the context of chronic wound healing. Then, we investigated the cellular mechanism mediating some of the responses stimulated by calcium, focusing on the implication of the calcium-sensing receptor (CaSR). Several agonists of the receptor stimulated similar effects than calcium, suggesting the relevance of the CaSR on fibroblasts behavior, and opening a window to the design of novel bioceramics that release CaSR-agonists. In order to test the healing capability of the above mentioned bioceramic particles in vivo, they were incorporated in a mat of poly(lactic acid) (PLA) fibers. This novel dressing was applied on a model of chronic wounds in vivo, and compared with a mat of particle-free PLA and to a frequently used commercially available dressing. We found that the PLA-bioceramic mat accelerated wound closure and increased vasculature at the injured site at initial time-points. Thus, improved healing was achieved with the newly designed dressing. Finally, a different composite material was synthesized combining bioceramic particles and human mesenchymal stromal cells (hMSC) in a degradable hydrogel, and its vasculogenic potential was evaluated in soft tissue. This material supported hMSC survival and stimulated the release of the angiogenic factor IGF-1 from these cells in vitro. In addition, when implanted in soft tissue of immunocompromised mice, the composite construct improved hMSC survival and generated a more mature vasculature at the site of implantation. In conclusion, this thesis shows that calcium-releasing bioceramics can successfully contribute to the treatment of chronic wounds and soft tissue regeneration.

Las heridas crónicas tienen un gran impacto socioeconómico sobre los países desarrollados, afectando especialmente a personas en edad avanzada y diabéticos. Se estima que entre el 1 y 2% de la población sufrirá una herida crónica a lo largo de su vida y, con el envejecimiento de la población y el aumento del sedentarismo, la incidencia de estas heridas seguirá una tendencia ascendente. Las heridas crónicas presentan una patofisiología complicada y diversa que las hace resistentes a las terapias actuales. Por esta razón, se están desarrollando nuevos productos mediante ingeniería de tejidos basados en el uso de factores de crecimiento y células. Sin embargo, la translación de estas terapias a la clínica es muy complicada por cuestiones regulatorias, económicas y de estabilidad del producto, por lo que hay una gran necesidad de nuevos tratamientos que puedan llegar más fácilmente al mercado. Recientemente, se ha descubierto que los biomateriales inorgánicos llamados biocerámicos pueden estimular la curación de heridas y la vascularización, principalmente a través del efecto de los iones que liberan. Partiendo de esta idea, este proyecto de tesis se ha centrado en investigar el uso potencial de nuevos biocerámicos en curación de heridas y la regeneración de tejido blando. Más concretamente, nos hemos centrado en el rol del ión calcio y su liberación de nuevos biocerámicos para estimular la curación de heridas y la formación de vasos sanguíneos in vitro e in vivo. A pesar de que el calcio afecta en todas las fases de la curación de una herida, las concentraciones y perfil de liberación que pueden mejorar el proceso de curación no han sido descritos. Por ello, evaluamos el efecto de diferentes concentraciones de calcio extracelular en fibroblastos dermales, un tipo celular esencial en el proceso de curación, y encontramos estimulación de diferentes respuestas biológicas a concentraciones específicas. Además, comparamos si se podían obtener efectos similares mediante el producto iónico liberado de unas nuevas partículas biocerámicas con concentraciones equivalentes de calcio. Curiosamente, el producto iónico inhibió algunos efectos estimulados por el calcio en solución que no son deseables en un contexto de tratamiento de heridas crónicas. Entonces, quisimos indagar en el mecanismo celular a través del cual el calcio estimula a los fibroblastos, centrándonos en la implicación del receptor sensor de calcio (CaSR). Varios agonistas de este receptor estimularon respuestas parecidas al calcio, mostrando la relevancia del CaSR sobre el comportamiento de los fibroblastos, y abriendo una ventana al diseño de nuevos biocerámicos con libración de agonistas del CaSR. Por otro lado, quisimos probar la capacidad curativa de las partículas biocerámicas usadas sobre los fibroblastos incorporándolas en fibras de ácido poliláctico. Este nuevo apósito generado se aplicó sobre un modelo de heridas crónicas in vivo, y su efecto se comparó con un apósito de PLA sin partículas y con un apósito comercial. El apósito de PLA-biocerámico aceleró la curación de las heridas además de estimular la formación de vasos sanguíneos a tiempos tempranos, con lo que se consiguió una mejora en la curación. Finalmente, se sintetizó un biomaterial implantable combinado partículas biocerámicas, células madre mesenquimales adultas (hMSC) y un hidrogel sintético degradable, con el objetivo de evaluar su capacitat vasculogénica en tejidos blandos. In vitro, el material mantuvo la superviencia de las células encapsuladas y se aumentó la liberación del factor angiogénico IGF-1. Además, al implantarse en tejido blando de ratones immunodeprimidos, el material con biocerámico mejoró la supervivencia de las hMSC y estimuló la maduración de la vasculatura en el sitio de implantación